三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分離與鑒定

閻斌倫，秦國(guó)民，暴增海，張曉君，畢可然，秦蕾

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005)

三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分離與鑒定

閻斌倫，秦國(guó)民，暴增海，張曉君，畢可然，秦蕾

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005)

從養(yǎng)殖病死三疣梭子蟹肝胰臟及心臟血淋巴液中分離到大量?jī)?yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的細(xì)菌，人工感染試驗(yàn)證明分離菌對(duì)三疣梭子蟹有較強(qiáng)的致病性；對(duì)分離菌進(jìn)行了形態(tài)特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物學(xué)性狀及16S rRNA和gyrB兩種基因的分子鑒定。菌株（JGX080708-1）所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 453bp（GenBank 登錄號(hào)：FJ824663），所擴(kuò)增的gyrB基因序列長(zhǎng)度為1 191bp（GenBank 登錄號(hào)：GQ372985）；兩種基因序列在NCBI通過(guò)blast檢索，結(jié)果均與弧菌屬細(xì)菌的基因序列自然聚類(lèi)；根據(jù)分離菌的表型及分子特征，判定分離菌為弧菌屬（Vibrio Pacini 1954）的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus（Fujino et al 1951）Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]。分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)供試49種抗菌藥物中的安曲南等42種藥物高度敏感，對(duì)林可霉素敏感，對(duì)青霉素G等6種藥物耐藥。

三疣梭子蟹；副溶血弧菌；16S rRNA基因；gyrB基因

Abstract:Dominant bacteria were isolated from diseased Portunus trituberculatus L.,and have strong pathogenicity to Portunus trituberculatus L.by artificial challenge.The phenotypic biological characters were examined,including morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics; and the activity of extracellulase and hemolysin.The molecular identification were also conducted,and the 16S rRNA and gyrB genes were partially sequenced and compared with sequences deposited in databases,moreover molecular phylogenetic trees were constructed.The sequenced 16S rRNA gene of strain JGX080708-1 (GenBank accession No.FJ824663)is 1,453bp in length,and the sequenced gyrB gene of strain JGX080708-1 (GenBank accession No.GQ372985)is 1,191bp in length.Blasting of 16S rRNA and gyrB genes in NCBI showed high homogeneity between the isolates and Vibrio sp.from GenBank database.The results showed that the identified strains belonged to Vibrio parahaemolyticus [(Fujino et al 1951)Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]of Vibrio (Pacini 1954)based on their phenotypic and molecular characteristics.Drug resistance of isolates to 49 antimicrobial agents was detected,and the results showed that isolates were high sensitive to 42 agents including aztreonam,and also sensitive to lincomycin,furthermore they were resistant to 6 agents including penicillin G.

Keywords：Portunus trituberculatus L.; Vibrio parahaemolyticus; 16S rRNA gene; gyrB gene

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，是一種大型海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)，廣泛分布于東南亞、東亞、非洲、美洲及澳大利亞等地的海域內(nèi)，中國(guó)沿海從南至北均有分布。三疣梭子蟹肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是人們極為喜愛(ài)的水產(chǎn)品，同時(shí)也是主要的出口創(chuàng)匯品種，隨著梭子蟹人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的突破，養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，已成為繼中國(guó)對(duì)蝦以后中國(guó)海水甲殼類(lèi)養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一，但由于養(yǎng)殖設(shè)施及管理不規(guī)范、養(yǎng)殖大環(huán)境逐日惡化等因素的影響，導(dǎo)致病害頻發(fā)，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。據(jù)王國(guó)良等報(bào)道溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)可引起三疣梭子蟹肌肉乳化病[1]；王高學(xué)等報(bào)道引起三疣梭子蟹“牛奶病”的病原為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)[2]；許文軍等認(rèn)為三疣梭子蟹“乳化病”由假絲酵母菌(Cnadida oleophila)感染引起[3]。

2008年7月，對(duì)江蘇贛榆某三疣梭子蟹養(yǎng)殖場(chǎng)所發(fā)生的疾病進(jìn)行了檢驗(yàn)，病蟹主要表現(xiàn)為?？拷哆吘徛蝿?dòng)，體色發(fā)紅，以附肢最為明顯，剝開(kāi)背甲檢查，鰓較混濁且附有污物，肝胰臟色淡。經(jīng)用顯微鏡對(duì)病梭子蟹肌肉、肝胰臟及鰓的檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)致病性寄生蟲(chóng)，隨機(jī)取4只被檢病蟹的肝胰臟及心臟血淋巴液做細(xì)菌學(xué)及致病性檢驗(yàn)，結(jié)果表明其病原為弧菌屬（Vibrio Pacini 1954）的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus（Fujino et al 1951）Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]，盡管副溶血弧菌作為水生動(dòng)物條件致病菌已多有報(bào)道，但目前尚未見(jiàn)有引起三疣梭子蟹感染發(fā)病的報(bào)道。為豐富該菌在宿主范圍、生物學(xué)性狀及分子生物學(xué)等方面的內(nèi)容，進(jìn)行了副溶血弧菌對(duì)三疣梭子蟹的致病性及其形態(tài)特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性、16S rRNA基因和gyrB基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析、對(duì)抗菌類(lèi)藥物的敏感性等系統(tǒng)研究，旨在對(duì)該菌的有效檢驗(yàn)及深入研究等提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離

病情嚴(yán)重但尚未死亡蟹（4只）經(jīng)多次用生理鹽水沖洗后又經(jīng)75%酒精棉擦拭消毒，以其肝胰臟及心臟血淋巴液為樣品，先經(jīng)抹片后革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌；再用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂及 Zobell 2216E海水培養(yǎng)基做劃線接種分離培養(yǎng)（28℃培養(yǎng)48 h檢查）細(xì)菌，取分離菌移接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂及Zobell 2216E海水瓊脂培養(yǎng)基斜面（28℃培養(yǎng)24 h）做純培養(yǎng)供檢驗(yàn)用。

1.2 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)用蟹選用2個(gè)月大小的健康幼蟹。將供試菌株(JGX080708-1)接種于含鹽1%的普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后作為供試菌液，采用浸浴及腿部肌肉注射兩種感染方式。腿部肌肉注射感染：每只接種0.2 mL（菌液濃度調(diào)至約3×107CFU/mL），共接種 10只；同時(shí)腿部肌肉注射同劑量、同批無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯做對(duì)照；浸浴感染：分別取25 mL、50 mL、100 mL的供試菌液（菌液濃度約1×108CFU/mL）加至1 000 mL的試驗(yàn)用海水中使活菌數(shù)分別達(dá)到2.5×106CFU/mL、5×106CFU/mL、1×107CFU/mL 3個(gè)不同濃度，分別浸浴感染健康幼蟹，每組浸浴感染15只幼蟹，同時(shí)無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯浸浴幼蟹做對(duì)照；全部試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行兩次。試驗(yàn)蟹均隔離養(yǎng)殖于試驗(yàn)水族箱中，觀察其感染后的發(fā)病與死亡情況，以引起試驗(yàn)幼蟹發(fā)病死亡并能重新分離回收到原感染菌作為分離菌致病性的判定指標(biāo)。

1.3 細(xì)菌鑒定

1.3.1 形態(tài)與菌落特征觀察及理化特性檢查取純培養(yǎng)菌分別移接于2 216 E海水瓊脂斜面置28 ℃培養(yǎng)20 h，制備涂片標(biāo)本進(jìn)行革蘭氏染色做形態(tài)特征檢查；純培養(yǎng)菌接種于2 216 E海水瓊脂及硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂(TCBS)培養(yǎng)基，置28 ℃培養(yǎng)24 h，檢查生長(zhǎng)情況。

取純培養(yǎng)菌，分別接種于細(xì)菌理化特性鑒定用培養(yǎng)基中，按常規(guī)進(jìn)行氧化酶、接觸酶、糖（醇及苷）類(lèi)代謝、H2S、吲哚、MR、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原、OF試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用（Simmons）等較系統(tǒng)的理化特性測(cè)定，主要參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[4]進(jìn)行；分離菌的胞外蛋白酶活性、脂酶活性、淀粉酶活性、尿素酶活性及溶血活性采用平板檢驗(yàn)方法，明膠酶活性采用試管液化方法。主要參照《人及動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)》[5]進(jìn)行。

1.3.2 16S rRNA 基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

1.3.2.1 PCR 模板DNA的制備 取純培養(yǎng)菌分別接種于含鹽1%的LB肉湯中28 ℃培養(yǎng)16 h，按小量細(xì)菌基因組 DNA抽提試劑盒（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)）所述方法提取 DNA作為PCR模板DNA。

1.3.2.2 16S rRNA和gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增的兩個(gè)引物分別為：27F（正向引物）：5'-AGA GTT TGA TC(C/A)TGG CTC AG-3'，1492R（反向引物）：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'[6]；gyrB基因PCR擴(kuò)增的兩個(gè)引物分別為：UP1（正向引物）：5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3'，UP2r（反向引物）：5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCRTCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3'[7]。試驗(yàn)方法參照張曉君等（2009）[8]。

1.3.2.3 16S rRNA和gyrB 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 對(duì)分離菌的16S rRNA基因和gyrB基因序列通過(guò) NCBI的 Blast檢索系統(tǒng)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進(jìn)行序列同源性分析，并使用ClustalX軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進(jìn)行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用MEGA3(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA)及 PAUP4.0最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）構(gòu)建MP樹(shù)，并通過(guò) Bootstrap 法（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)。

1.3.3 菌種分類(lèi)位置確定 根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測(cè)定的結(jié)果，主要依據(jù)《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.9th ed》[9]、《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[10]及有關(guān)資料，并結(jié)合細(xì)菌發(fā)育學(xué)分析的結(jié)果，進(jìn)行分離菌的種屬分類(lèi)位置判定。

1.4 藥物敏感性測(cè)定

經(jīng)鑒定后的菌株，用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散（K-B）法進(jìn)行對(duì)常用抗菌類(lèi)藥物的敏感性測(cè)定，以是否出現(xiàn)抑菌圈及抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標(biāo)[11]。

2 結(jié) 果

2.1 病變組織中的細(xì)菌與細(xì)菌分離

在4只被檢三疣梭子蟹的肝胰臟及心臟血淋巴液中，均存在大量革蘭氏陰性、排列不規(guī)則，多數(shù)散在、偶爾成雙排列，無(wú)芽孢、大小多在0.4～0.8 μm×1.0～2.0μm 的桿菌。

自4只被檢三疣梭子蟹的肝胰臟中均分離到了大量同種細(xì)菌。培養(yǎng)24 h檢查其菌落特征為圓形光滑、不透明、隆起、邊緣較整齊、直徑多在0.5 mm左右，48 h的菌落直徑多在1.0 mm左右。隨機(jī)取 2個(gè)菌落做純培養(yǎng)，其編號(hào)為：JGX080708-1～2。

2.2 分離菌的致病性

在兩次重復(fù)進(jìn)行的人工感染試驗(yàn)中，分離菌(JGX080708-1)經(jīng)浸泡及肌肉注射感染健康幼蟹后，供試幼蟹在5 h至12 h全部死亡，部分死蟹出現(xiàn)明顯的附肢發(fā)紅。兩種感染方式的對(duì)照組幼蟹在48 h觀察期內(nèi)均正常；取上述不同途徑感染死亡蟹的肝胰臟及心臟血淋巴液，分別做抹片經(jīng)革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均有大量在形態(tài)特征上同原感染菌的細(xì)菌；同時(shí)均分離到了原感染菌的菌落，取感染死亡蟹的分離菌落做純培養(yǎng)2株，分別進(jìn)行形態(tài)特征及主要理化特性指標(biāo)的復(fù)核鑒定，結(jié)果均與原感染菌一致。試驗(yàn)證明分離菌為本次引起三疣梭子蟹大量死亡的病原菌且具有相當(dāng)強(qiáng)的致病性。

2.3 形態(tài)特征與培養(yǎng)特性

2株純培養(yǎng)菌的形態(tài)一致，均為革蘭氏染色陰性、桿狀、散在（個(gè)別成雙）、無(wú)芽孢、大小多在 0.3 ～ 0.8μm×1.0～ 2.0 μm 的細(xì)菌。在 2216E 海水瓊脂培養(yǎng)基上邊緣較整齊、隆起、光滑、濕潤(rùn)、不透明、直徑在2 mm左右；在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h為圓形光滑、稍隆起、表面有光澤、直徑多在1.2mm左右的綠色菌落，生長(zhǎng)良好。

2.4 理化性狀

分離菌所測(cè)主要理化性狀的反應(yīng)結(jié)果一致（見(jiàn)表1）。酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2株供試菌的胞外產(chǎn)物具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，但不具有脲酶和明膠酶活性；在含 7%家兔脫纖血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，呈β型溶血現(xiàn)象。

2.5 16S rRNA 基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

分離菌（JGX080708-1）所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為 1 453 bp（GenBank 登錄號(hào)：FJ824663）；所擴(kuò)增的gyrB基因序列長(zhǎng)度為1 191 bp（GenBank 登錄號(hào)：GQ372985）。

將JGX080708-1株的16S rRNA基因序列在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果與弧菌屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列自然聚類(lèi),檢索出的弧菌有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、需鈉弧菌(Vibrio natriegens)及坎氏弧菌(Vibrio campbellii)，供試菌與這些弧菌的的基因序列相似性均可達(dá)到98%至99%。選取了檢索出的部分菌株和1株外圍菌（嗜水氣單胞菌，登錄號(hào)：AF468055）的16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，其MP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示，由圖1很難將分離菌進(jìn)行歸屬分類(lèi)。將分離菌（JGX080708-1）所擴(kuò)增的gyrB基因序列在NCBI通過(guò)Blast進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果檢索出的均為弧菌屬細(xì)菌的gyrB基因序列，主要包括副溶血弧菌（V.parahaemolyticus），相似性在98%～99%；另外檢索出的有溶藻酸弧菌（V.alginolyticus）、哈氏弧菌(V.harveyi)、坎氏弧菌（V.campbellii）、需鈉弧菌(V.natriegens)及輪蟲(chóng)弧菌（V.rotiferianus），分離菌的gyrB基因序列與這些弧菌的相似性在 84%～88%，未達(dá)到種的要求。選擇一株嗜水氣單胞菌的 gyrB基因序列（登錄號(hào)：AF208258）作為外圍菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，其MP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。在圖2的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中，分離菌（JGX080708-1）和選擇的10株副溶血弧菌聚為一個(gè)大分支，且自舉值為100%。

表1 分離菌的理化特性結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of isolates

圖1 JGX080708-1株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖中AF468055至EU660312為菌株在NCBI的登錄號(hào),數(shù)字為自舉值)Fig.1 Phylogenetic tree based on JGX080708-1 16S rRNA genesequences (AF468055～ EU660312 were database accession numbers in NCBI,and numbers above branches in the tree are bootstrap values)

2.6 菌種分類(lèi)位置

結(jié)合形態(tài)觀察、普通的生理生化特征、16S rRNA及gyrB基因的分子特征，判定分離菌為弧菌屬（Vibrio Pacini 1954）的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus（Fujino et al 1951）Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]。

圖2 JGX080708-1株gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖中AF208258至FM999818為菌株在NCBI的登錄號(hào),數(shù)字為自舉值)Fig.2 Phylogenetic tree based on JGX080708-1 gyrB gene sequences(AF208258～ FM999818 were database accession numbers in NCBI,and numbers above branches in the tree are bootstrap values)

2.7 藥物敏感性

2株分離菌對(duì)供試49種抗菌類(lèi)藥物敏感性株間無(wú)差異，均對(duì)安曲南等42種藥物高度敏感（抑菌圈直徑在20～60 mm）；對(duì)林可霉素敏感（抑菌圈直徑在12 mm）；對(duì)青霉素G等6種耐藥（抑菌圈直徑在0～8 mm）；具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 藥敏紙片名稱(chēng)和規(guī)格及病原副溶血弧菌的藥物敏感性Tab.2 Name and type of discs and antimicrobial sensitivity of pathogenic V.parahaemolyticus

3 結(jié)語(yǔ)與討論

副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)廣泛存在于世界各地近海岸的海水、海底沉積物及海生動(dòng)物中，在河口入海處和鹽堿地區(qū)也可以分離到。已有研究資料表明，副溶血弧菌可引起人和動(dòng)物（主要是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物如魚(yú)、蝦、蟹、貝等）的感染發(fā)病，因此也被認(rèn)為是一種人與水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物共染的病原菌。有記述該菌可引起大黃魚(yú)、斑節(jié)對(duì)蝦、對(duì)蝦、河蟹、鋸緣青蟹、九孔鮑及文蛤等的感染發(fā)病[12-19]。此外，副溶血弧菌在人的感染主要為腸炎或食物中毒，自1950年藤野從日本大阪市發(fā)生的食物中毒病例分離到副溶血弧菌以來(lái)，世界許多國(guó)家如日本、中國(guó)、澳大利亞、印度、美國(guó)、越南、泰國(guó)、多哥、馬來(lái)西亞、新加坡、俄羅斯、巴拿馬、新西蘭、羅馬尼亞、墨西哥等均陸續(xù)報(bào)告了副溶血弧菌食物中毒或腸炎。本次通過(guò)對(duì)發(fā)病三疣梭子蟹肝胰臟及心臟血淋巴液抹片直接染色發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，并有規(guī)律地分離到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的細(xì)菌，人工感染試驗(yàn)?zāi)芤鸾】涤仔返陌l(fā)病與死亡并回收到原感染菌等方面的研究，以及對(duì)分離菌進(jìn)行了主要理化特性方面較系統(tǒng)的檢驗(yàn)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，表明所檢出的細(xì)菌為副溶血弧菌且為被檢病蟹的相應(yīng)病原菌，進(jìn)一步表明了該菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中的廣泛致病作用。

細(xì)菌核糖體中的16S rRNA常用于細(xì)菌的鑒定與分類(lèi)研究，該基因序列幾乎可以對(duì)所有的細(xì)菌進(jìn)行屬水平上的鑒定[20]，但由于16S rRNA在進(jìn)化中高度保守，對(duì)于種間水平的鑒定往往分辨率不足,對(duì)相似率極高的近緣種無(wú)法作進(jìn)一步的區(qū)分[21]。本次對(duì)于分離菌在進(jìn)行常規(guī)的形態(tài)特征、理化特性等表型生物學(xué)性狀檢驗(yàn)的同時(shí)，又進(jìn)行了16S rRNA和gyrB兩種基因的分子鑒定，比較了16S rRNA和gyrB兩種基因?qū)Ω比苎【蔫b別能力。分離菌（JGX080708-1）16S rRNA基因序列在NCBI通過(guò)blast檢索，檢索結(jié)果為5種弧菌，即副溶血弧菌、哈氏弧菌、溶藻酸弧菌、需鈉弧菌及坎氏弧菌，且分離菌與這些弧菌的16S rRNA基因序列相似性均達(dá)到了98%～99%，均可達(dá)到種的要求，在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中（圖 1），JGX080708-1未與上述5種弧菌的任何一種聚為一個(gè)類(lèi)群，本研究表明在副溶血弧菌分子鑒定中，用16S rRNA基因序列很難將其與屬內(nèi)親緣關(guān)系很近的種區(qū)分開(kāi)。分離菌(JGX080708-1)gyrB基因序列在NCBI通過(guò)blast檢索，檢索結(jié)果為6種弧菌，即副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、哈氏弧菌、坎氏弧菌、需鈉弧菌及輪蟲(chóng)弧菌，分離菌的gyrB基因序列除與副溶血弧菌的相似性達(dá)到98%～99%外，與其他弧菌的相似性均只有84%～88%，未達(dá)到種的要求，且在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中（圖2）也明顯地與選擇的10種副溶血弧菌聚為一個(gè)類(lèi)群。本研究進(jìn)一步表明在副溶血弧菌的檢測(cè)和鑒別方面，編碼DNA解旋酶B亞單位的gyrB基因比核糖體中的16S rRNA基因更具優(yōu)越性。

在副溶血弧菌對(duì)抗菌類(lèi)藥物敏感性的研究方面，劉葒等(1999)報(bào)道分離于斑節(jié)對(duì)蝦“紅體病(red body disease)”的副溶血弧菌對(duì)氟哌酸、紅霉素、青霉素和強(qiáng)力霉素較為敏感[13]；李文寬等(1999)報(bào)道引起遼寧地區(qū)河蟹暴發(fā)性流行病的副溶血弧菌對(duì)呋喃唑酮、磺胺、鏈霉素、卡那霉素、磺胺+甲氧芐氨嘧啶敏感[16]；毛芝娟等(2001)報(bào)道分離于鋸緣青蟹的副溶血弧菌對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素等抗菌藥物表現(xiàn)出強(qiáng)敏感性，對(duì)諾氟沙星、磺胺甲異噁唑等中度敏感，對(duì)頭孢唑啉、呋喃唑酮等不敏感，中草藥五倍子和五味子也有較強(qiáng)的抑菌作用[17]；張朝霞等(2001)報(bào)道分離于九孔鮑的副溶血弧菌對(duì)鏈霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、妥布霉素、強(qiáng)力霉素、多黏菌素B、復(fù)方新諾明、磺胺甲基異噁唑等藥物高度敏感，對(duì)四環(huán)素、新霉素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星等中度敏感，對(duì)紅霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素、氟哌酸、呋喃唑酮、氨芐青霉素、呋喃妥因等耐藥[18]；本次對(duì)分離于三疣梭子蟹的副溶血弧菌進(jìn)行的對(duì)供試 49種抗菌類(lèi)藥物的敏感性測(cè)定，結(jié)果對(duì)安曲南等42種藥物高度敏感（抑菌圈直徑在20～60 mm）；對(duì)林可霉素敏感（抑菌圈直徑在12 mm）；對(duì)青霉素G等6種耐藥，這些可作為在藥物防治副溶血弧菌感染時(shí)選擇用藥及對(duì)副溶血弧菌耐藥規(guī)律研究的參考。

副溶血弧菌作為人食物中毒和腸炎以及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病原菌已被確認(rèn)，目前對(duì)于該菌的毒力因子尚在研究之中，其中較為明確的是耐熱性溶血毒素(TDH)以及不耐熱的與 TDH相關(guān)的溶血毒素(TRH)；副溶血弧菌的胞外產(chǎn)物(ECP)具有多種酶活性，單獨(dú)注射感染即可導(dǎo)致中國(guó)對(duì)蝦的嚴(yán)重發(fā)病及死亡[22]；此外，研究發(fā)現(xiàn)尿素酶與副溶血弧菌的致病性之間存在一定關(guān)系，以往認(rèn)為副溶血弧菌的尿素酶為陰性，尿素酶陽(yáng)性的菌株與人的感染聯(lián)系不大，但有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)尿素酶陽(yáng)性菌株與 TRH之間呈正向聯(lián)系。本次通過(guò)對(duì)引起三疣梭子蟹感染發(fā)病的副溶血弧菌進(jìn)行胞外酶活性及溶血活性檢測(cè)，表明本次分離的病原副溶血弧菌具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，但不具有脲酶和明膠酶活性，且具有溶血活性，可為副溶血弧菌毒力因子的深入研究提供參考。

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Isolation and identification of Vibrio parahaemolyticus from diseased Portunus trituberculatus L.

YAN Bin-lun,QIN Guo-min,BAO Zeng-hai,ZHANG Xiao-jun,BI Ke-ran,QIN Lei
(College of Ocean,Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China)

S945; Q939.1

A

1001-6932(2010)05-0560-07

2009-03-25；

2009-12-29

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2006BAD09A01)；江蘇省水產(chǎn)三項(xiàng)工程項(xiàng)目（PJ2010-58）；淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室研究基金（2008HS016）資助

閻斌倫（1962－），男，教授，主要從事海洋生物技術(shù)與應(yīng)用研究。電子郵箱：E-mail:yanbinlun@yahoo.com.cn