大黃魚(yú)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因外顯子Ⅱ遺傳多態(tài)性分析

楊斌，薛良義，葉秀麗，董小敬

（寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211）

大黃魚(yú)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因外顯子Ⅱ遺傳多態(tài)性分析

楊斌，薛良義，葉秀麗，董小敬

（寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211）

肌肉生長(zhǎng)抑制素是控制動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的重要細(xì)胞因子，采用PCR-SSCP和測(cè)序方法分析了150尾大黃魚(yú)樣本肌肉生長(zhǎng)抑制素基因(myostatin）外顯子Ⅱ的單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外顯子Ⅱ中有10個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別是29、131、206、261、231、243、265、273、297和300位。其中131位點(diǎn)T →A突變引起相應(yīng)的氨基酸由L→Q，265位點(diǎn)T→C突變引起相應(yīng)氨基酸由C→R，261位點(diǎn)A→G突變引起相應(yīng)氨基酸由S→G，231位點(diǎn)的T→C突變引起相應(yīng)氨基酸由W→S，273位點(diǎn)的C→T突變引起相應(yīng)的氨基酸由R→W,297位點(diǎn)的A→G突變引起相應(yīng)氨基酸由I→V,243位點(diǎn)的G→A突變引起相應(yīng)氨基酸由D→N,300位點(diǎn)的G→A突變引起相應(yīng)氨基酸由E→K。29位點(diǎn)A →G和206位點(diǎn)C→A均屬于同義突變。存在6種基因型，他們的基因頻率分別是0.57、0.23、0.10、0.04、0.02、0.04，該基因位點(diǎn)的雜合度為0.33。

大黃魚(yú)；肌肉生長(zhǎng)抑制素基因；單鏈構(gòu)象多態(tài)性；生長(zhǎng)性狀

Abstract:Myostatin (MSTN )as an important cytokine controls the growth and development of skeletal muscle in animals.Ten single nucleotide polymorphisms (SNPs)were totally identified in the exon Ⅱof MSTN gene from 150(70 of one –year old and 80 of two-year old)large yellow croakers，Pseudosciaena crocea，individuals by PCR-SSCP and sequencing.The ten polymorphic sites were located at 29(A→G),131(T→A),206(C→A),231(T→C),243(G→A),261(A→G),265(T→C),273(C→T),297(A→G)and 300(G→A).Base mutations at sites 131,265,261,231,273,297,243 and 300 resulted in amino acid substitutions of L→Q,C→R,S→G,W→S,R→W,T→V,D→N and E→K,respectively.However,base mutations at sites 29 and 206 did not cause amino acid substitution.There were six genotypes in the examined population,whose frequency was 0.57、0.23、0.10、0.04、0.02and 0.04,respectively.The heterozygosity of MSTN locus was 0.33.

Keywords:Pseudosciaena crocea; MSTN; SSCP; growth trait

生長(zhǎng)分化因子 8（growth and differentiation factor-8，GDF-8）基因最先由MePherron等從小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)中篩選得到，因它對(duì)小鼠骨骼肌的生長(zhǎng)起抑制作用，故又稱(chēng)為肌肉生長(zhǎng)抑制素基因（myostatin，MSTN）[1]。在斑馬魚(yú)(Danio rerio)中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因和RNAi技術(shù)抑制該基因的功能,試驗(yàn)魚(yú)的肌肉明顯較正常魚(yú)發(fā)達(dá),證實(shí)該基因參與魚(yú)類(lèi)肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控[2,3]。目前已在斑馬魚(yú)（Danio rerio）、溪紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fontinalis）、虹鱒魚(yú)（Oncorhynchus mykiss）、銀大麻哈魚(yú)(Oncorhynchus kisutch）、大麻哈魚(yú)（Salmo salar）和金頭鯛（Sparus aurata）等多種魚(yú)類(lèi)中克隆得到了MSTN基因[4-15]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)MSTN基因在結(jié)構(gòu)上與高等脊椎動(dòng)物有高度的相似性，但在組織表達(dá)上存在較大差異。哺乳動(dòng)物中，MSTN基因除了在小鼠的骨骼肌中表達(dá)，在豬的乳腺、牛的蒲肯野氏纖維和心肌細(xì)胞中也有一定程度的表達(dá)[16,17]。在魚(yú)類(lèi)，MSTN基因除了在骨骼肌中表達(dá)，還在眼球、鰓絲、腦、腸、生殖腺、脂肪等組織中表達(dá)，表達(dá)范圍比哺乳類(lèi)要廣泛[8,17]。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)是生物體基因組中存在最廣泛的一類(lèi)變異，稱(chēng)為第3代分子標(biāo)記，在基因組和基因功能研究中具有重要的作用。單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）作為檢測(cè)基因多態(tài)性的方法，簡(jiǎn)便、快速、靈敏，不但可用于檢測(cè)基因點(diǎn)突變和短序列的缺失和插入，而且還被用于DNA定量分析，監(jiān)測(cè)PCR診斷實(shí)驗(yàn)中的交叉污染情況。已有研究表明，牛、豬、雞等畜禽MSTN突變等位基因與動(dòng)物肌肉產(chǎn)量相關(guān)，如比利時(shí)藍(lán)牛的MSTN基因外顯子Ⅲ缺失11bp造成移碼突變，使缺失突變后面的第14位密碼子變?yōu)榻K止密碼子，合成無(wú)功能的MSTN蛋白，使其骨骼肌數(shù)量是其他品種的4倍[18,19]。雞MSTN基因外顯子I的兩個(gè)點(diǎn)突變，造成Bsh1236I和Msp I酶切位點(diǎn)的消失，導(dǎo)致其胸重肌和胸肌率顯著提高[20]。目前對(duì)魚(yú)類(lèi)MSTN基因與生長(zhǎng)相關(guān)性的報(bào)道有本實(shí)驗(yàn)室之前發(fā)表的大黃魚(yú)MSTN基因外顯子I遺傳多態(tài)性分析[21]。大黃魚(yú)是中國(guó)的名貴魚(yú)類(lèi)，也是重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi),筆者在克隆大黃魚(yú) MSTN 基因的基礎(chǔ)上，對(duì)該基因外顯子Ⅱ的遺傳多態(tài)性及與生長(zhǎng)的相關(guān)性進(jìn)行了初步分析，以期為尋找與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的候選標(biāo)記位點(diǎn)打下基礎(chǔ)[15]。

1 材料和方法

1.1 材 料

150尾大黃魚(yú)樣本（其中1齡70尾，2齡80尾）取自浙江象山港同一網(wǎng)箱養(yǎng)殖群體，經(jīng)測(cè)量體質(zhì)量、體長(zhǎng)后，用無(wú)菌剪刀取肌肉組織分裝于 1.5ml離心管，并迅速置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用常規(guī)的酚-氯仿法提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆的大黃魚(yú)MSTN 基因序列(GenBank AY842934)，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增引物 W2F:5’-AGCCGAGTCCGTCGTCCAAG-3’和 W2R: 5’-ATAAAGGTTCAGCTCACCAGTCC-3’，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增目的片段為MSTN 基因的外顯子Ⅱ，長(zhǎng)度為371bp。

PCR 反應(yīng)體系: 10×PCR buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，dNTP(每種 10 mmol/L)0.5μl，引物(每種 20 μmol/L)各 0.5μl，TaqDNA 聚合酶 1U，模板DNA 50 ng，反應(yīng)總體積為25 μl。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min，30個(gè)循環(huán)(94 ℃，30 s；54.5℃，30 s；72 ℃，30 s)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.2.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 取PCR產(chǎn)物10 μl放入滅菌的小離心管中，加入 2μl變性上樣緩沖液(95%甲酰胺、0.05%溴酚藍(lán)、20 mmol/L EDTA)；98 ℃水浴變性10 min，冰浴5 min；12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acro /Bis為29:1)電泳8～9 h(10 V/cm)；0.2%硝酸銀染色。

1.2.4 克隆和測(cè)序 對(duì)具單鏈構(gòu)象多態(tài)性的PCR擴(kuò)增片段用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工)進(jìn)行純化,步驟參照其說(shuō)明書(shū)。純化產(chǎn)物的連接采用PMD18–T Vector試劑盒(大連寶生物公司)，轉(zhuǎn)化菌株為DH5α。陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR法鑒定后，送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 基因頻率按公式Pi=[2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)]/2N計(jì)算，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，i為純合復(fù)等位基因，j1，j2…jn分別為與i共顯的第1至n個(gè)等位基因?；蛐皖l率的計(jì)算方法為:基因型頻率=基因型個(gè)體數(shù)/測(cè)定群體總數(shù)。群體雜合度(Heterozygosity)根據(jù)Nei公式計(jì)算:

式中：h為群體內(nèi)該基因位點(diǎn)的雜合度，為該位點(diǎn)所具有的等位基因數(shù)，Pi為該位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因頻率。

多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）按照Botstein等。（1980）公式計(jì)算：

式中Pi、Pj分別為種群中第i、j個(gè)等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

利用 SPSS 軟件包中的 GLM (General linear model )分析不同基因型對(duì)大黃魚(yú)體質(zhì)量和體長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段PCR擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的片段如圖1，與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度相符，且條帶亮度較好，沒(méi)有非特異性條帶，可用于SSCP分析。

2.2 SSCP分析

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表現(xiàn)出6種基因型，其中兩條帶型的有兩種，分別命名為AA，CC型；3條帶型的有3種，分別命名為 AB，AC，AD，4條帶型的有 1種，命名為AE。

圖1 大黃魚(yú)MSTN基因外顯子ⅡPCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophotogram of PCR product of Exon Ⅱof MSTN in the large yellow croaker

圖2 150尾大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型示意圖Fig.2 Schematic diagram above shows results of PCR-SSCP on MSTN Exon Ⅱ of 150 large yellow croakers

2.3 MSTN基因不同基因型外顯子Ⅱ的序列測(cè)定

對(duì)不同基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收測(cè)序，并與GeneBank中登錄的序列（AY842934）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AA型與AY842934序列一致，其他基因型均存在不同程度的單核苷酸突變。在外顯子II中有 10 個(gè)突變位點(diǎn)，分別是 29（A →G）、131（T→A）、206（C→A）、261（A→G）、243（G→A）、300（G→A）、265（T→C）、231（T→C）、273（C→T）、297（A→G）。其中 131位點(diǎn) T →A突變引起相應(yīng)的氨基酸由L→Q，265位點(diǎn)T→C突變引起相應(yīng)氨基酸由C→R，261位點(diǎn)A→G突變引起相應(yīng)氨基酸由S→G，231位點(diǎn)的T→C突變引起相應(yīng)氨基酸由W→S，273位點(diǎn)的C→T突變引起相應(yīng)的氨基酸由R→W，297位點(diǎn)的A→G突變引起相應(yīng)氨基酸由I→V，243位點(diǎn)的G→A突變引起相應(yīng)氨基酸由D→N，300位點(diǎn)的G→A突變引起相應(yīng)氨基酸由E→K。29位點(diǎn)A →G和206位點(diǎn)C→A均屬于同義突變，未引起氨基酸的變化（表1）。AB型和AC型外顯子Ⅱ部分序列見(jiàn)圖4。

運(yùn)用EBI網(wǎng)站里的Transeq工具，將不同基因型的大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ序列翻譯為氨基酸序列，分析不同基因型大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ序列堿基突變引起的相應(yīng)氨基酸序列變化（圖5）。

2.4 外顯子Ⅱ的基因型及基因頻率

在150尾大黃魚(yú)肌肉樣本中AA型個(gè)體最多有85尾，其次是AB型，共有34尾，突變基因型AE個(gè)體最少只有3尾。AA、AB、AC、AD、AE、CC這6種基因型的基因頻率分別為0.57、0.23、0.10、0.04、0.02、0.04。等位基因A、B、C、D、E的頻率分別為0.763、0113、0.09、0.024、0.01。經(jīng)過(guò)計(jì)算，150尾大黃魚(yú)肌肉樣本的基因的雜合度為0.33，多態(tài)信息含量PIC=0.37。

圖3 大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ測(cè)序圖（A圖為AB型外顯子Ⅱ序列，突變發(fā)生在外顯子Ⅱ29位A→G，B圖為AC型外顯子Ⅱ序列，突變發(fā)生在外顯子Ⅱ131位T→A）Fig.3 Sequence analysis of MSTN gene Exon Ⅱ of the large yellow croaker

圖4 大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ不同基因型序列編碼的氨基酸序列Fig.4 Sequences of Amino acid translated from MSTN gene Exon Ⅱof the large yellow croaker with different genetypes

3 討 論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的很多研究都證明了MSTN基因具有突變和多態(tài)性并影響到了生物的生長(zhǎng)發(fā)育等性狀，如McPherron等發(fā)現(xiàn)比利時(shí)藍(lán)牛中MSTN基因缺失11 bp，導(dǎo)致該基因閱讀框架發(fā)生改變，分子活性區(qū)域消失，出現(xiàn)肌肉特別發(fā)達(dá)的雙肌牛，皮埃蒙特牛的MSTN基因外顯子I中C突變成A，外顯示子3中G突變成A，從而導(dǎo)致雙肌牛[22]。在人類(lèi)中也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)MSTN基因的天然突變，外顯子I的G→A 突變，導(dǎo)致108 bp長(zhǎng)度的mRNA被錯(cuò)誤剪輯，使MSTN基因編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度減少，喪失其功能，其表型與MSTN基因敲除小鼠的表型類(lèi)似，骨骼肌比正常人要發(fā)達(dá)。國(guó)內(nèi)對(duì)雞(Gallus gallus)、豬(Sus scrofa)、綿羊(Ovis aries)等的研究也表明MSTN 存在多態(tài)性[20,23-26]。在本研究中，大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ存在多處單堿基突變，除了同義突變外，還有導(dǎo)致氨基酸水平上發(fā)生改變的錯(cuò)義突變，如L→Q，C→R，S→G，W→S，R→W，I→V，D→N和E→K，使得大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ的PCR-SSCP結(jié)果較為復(fù)雜。

群體的雜合度是表示在被檢測(cè)的位點(diǎn)上群體中的雜合子頻率，群體平均雜合度的高低反應(yīng)了群體的遺傳一致性程度，平均雜合度越高，群體的遺傳一致性就越低，其遺傳多樣性越高。本試驗(yàn)中的大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ雜合度h為0.33，遠(yuǎn)低于大黃魚(yú)MSTN基因3’-UTR區(qū)內(nèi)（CA）n微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列[28]的雜合度（0.93），也低于大黃魚(yú)MSTN 基因外顯子Ⅰ[21]的雜合度（0.709）。顯示該群體中MSTN基因外顯子Ⅱ的一致性較高，表明大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ在遺傳過(guò)程中較上述兩個(gè)序列更為保守。據(jù)單淇[32]報(bào)道，長(zhǎng)江流域瑞昌、寧河和長(zhǎng)沙3地鳙魚(yú)mtDNA D-loop區(qū)段限制性片段的雜合度分別為0.6883、0.4459和0.2379。由于基因、基因互作和基因組背景效應(yīng)的復(fù)雜性，群體雜合度和性狀之間不是簡(jiǎn)單的相關(guān)關(guān)系,因此有必要進(jìn)一步研究大黃魚(yú)MSTN基因各外顯子群體雜合度和生長(zhǎng)性狀的關(guān)系[29,30]。

多態(tài)信息含量是基因多態(tài)信息高低的一個(gè)指標(biāo)，當(dāng) PIC＞0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)基因座，標(biāo)記可提供信息較多，當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)基因座，標(biāo)記提供的信息較合理；當(dāng) PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)基因座，標(biāo)記提供的信息較差[27]。本文分析中的大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ的PIC為0.37，屬于中度多態(tài)基因座位，較之前本實(shí)驗(yàn)室研究的大黃魚(yú)MSTN基因3’-UTR區(qū)內(nèi)（CA）n微衛(wèi)星序列，以及大黃魚(yú)MSTN基因外顯子I序列的多態(tài)信息含量要低，這與群體雜合度的結(jié)果一致[21,28]。在哺乳動(dòng)物中，東北馬鹿的MSTN基因多態(tài)信息含量為0.17，說(shuō)明該基因在高等動(dòng)物中可能更加保守[31]。

MSTN基因多態(tài)性與相關(guān)性狀間的關(guān)系，近年來(lái)在家禽畜中已有較多的報(bào)道,如李紹華等的研究表明，大白豬(Sus scrofa)MSTN基因的外顯子Ⅱ有3種基因型，外顯子Ⅲ有2種基因型，外顯子Ⅱ的多態(tài)性與生產(chǎn)性狀不相關(guān)，而外顯子Ⅲ的多態(tài)性與豬的背膘厚呈顯著性相關(guān)[25]。在的大黃魚(yú)MSTN基因的研究中，外顯子Ⅰ的多態(tài)性與與大黃魚(yú)體重、體長(zhǎng)呈顯著性相關(guān)[21]，這些結(jié)果表明MSTN基因不同的外顯子多態(tài)性對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀具有不同的影響。在本研究中，僅對(duì)1齡和2齡大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行了分析，并將以此為基點(diǎn)探討分析大黃魚(yú)MSTN基因外顯子Ⅱ與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系。

致謝：寧波大學(xué)生命科學(xué)院薛良義教授對(duì)本文寫(xiě)作進(jìn)行了指導(dǎo)和幫助，實(shí)驗(yàn)室成員黃偉、李婷、董海陽(yáng)、劉曉飛等參加象山養(yǎng)殖場(chǎng)取樣工作，在此一并致謝。

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Gentic polymorphism analysis of exon Ⅱ in MSTN gene from large yellow croaker,Pseudosciaena crocea

YANG Bin,XUE Liang-yi,YE Xiu-li,DONG Xiao-jing
(College of Life Science and Biotechnology,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Q959.483; Q31

A

1001-6932(2010)05-0554-06

2009-10-12；

2009-12-28

國(guó)家863項(xiàng)目（2006AA10A405）和國(guó)家自然科學(xué)基金（30871916）

楊斌（1982－），男，浙江人，碩士。研究方向：海洋生物基因資源，電子郵箱：bluestar180@sina.com

薛良義，教授，從事水產(chǎn)生物技術(shù)研究。電子郵箱：xueliangyi@nbu.edu.cn