轉(zhuǎn)WMV-2CP基因西瓜中間試驗(yàn)的農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)

應(yīng)奇才，徐祥彬，施農(nóng)農(nóng)，王慧中

(杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

近年來(lái)，西瓜病毒病日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的損失。報(bào)道顯示，我國(guó)西瓜花葉病毒病的平均發(fā)病率超過(guò)30%，個(gè)別品種甚至高達(dá)100%，造成西瓜產(chǎn)量年平均減產(chǎn)30%～40%，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1.5億元左右。使用化學(xué)農(nóng)藥殺滅病毒傳播介體 (如飛虱、葉蜱等)可以在一定程度上降低發(fā)病率。然而，對(duì)于病毒本身，由于其寄生于植株細(xì)胞內(nèi)，與寄主細(xì)胞共存，人們難以找到既對(duì)病毒有殺傷作用又對(duì)寄主無(wú)損害的選擇性化學(xué)藥物。因此，選育西瓜抗病新品系或品種，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1999年，作者采用基因工程方法，利用西瓜組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)成功地把WMV-2CP基因轉(zhuǎn)入浙密2號(hào)西瓜，獲得轉(zhuǎn)基因植株［1］。經(jīng)過(guò)10年的培養(yǎng)試驗(yàn)，獲得了大量的轉(zhuǎn)基因西瓜農(nóng)藝性狀資料。本文主要對(duì)轉(zhuǎn)WMV-2CP基因西瓜后代農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，以便為進(jìn)一步推廣轉(zhuǎn)WMV-2CP基因浙密2號(hào)西瓜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)西瓜花葉病毒2號(hào)外殼蛋白基因西瓜 R1、R2代種子。

1.2 方法

1.2.1 西瓜基因組DNA提取

以轉(zhuǎn)WMV-2CP基因西瓜植株和未轉(zhuǎn)化的西瓜植株為材料，利用 CTAB法提取基因組 DNA［2］，作為PCR擴(kuò)增模板。

1.2.2 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)WMV-2CP基因西瓜后代分離及基因飄移情況

根據(jù)WMV-2CP基因序列設(shè)計(jì)并合成2條引物［3］(引物由上海 Sangon 公司合成)，W1:5′-TCC ATG GCA GCC AAG GAG AAG GAA GG-3′;W2:5′-TTG TCG ACA ACA AAC ATT GCC GCA-3′。以轉(zhuǎn)WMV-2CP基因和未轉(zhuǎn)基因的西瓜DNA為模板，PCR擴(kuò)增WMV-2CP基因。PCR反應(yīng)體系均為:10 × Buffer 5 μL，10 mmoL·L-1dNTP 2 μL，PCR引物各25 mol，DNA 模板 1 μL(約 200 ng)，Taq酶2 U，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)步驟為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)33次;最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株病毒抗性檢測(cè)

WMV-2按常規(guī)方法摩擦接種于西葫蘆幼苗的子葉上，測(cè)定鑒別寄主的反應(yīng)。接種20 d出現(xiàn)病葉發(fā)皺、葉緣鋸齒狀、葉片有濃綠皰狀突起等典型癥狀后，收集病葉，提純 WMV-2［4］。病毒制劑作適當(dāng)稀釋后進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定，最低吸收峰在245 nm，最高吸收峰在260 nm，基本顯示一個(gè)核蛋白吸收光譜，磷鎢酸負(fù)染電鏡觀察表明，病毒粒為長(zhǎng)約750 nm的柔性線(xiàn)條狀結(jié)構(gòu)。

轉(zhuǎn)基因植株和陰性對(duì)照植株采用對(duì)比法種植，4月中旬播種，試驗(yàn)地點(diǎn)分2組，1組在中國(guó)水稻研究所防蟲(chóng)溫室，另1組在西瓜種植試驗(yàn)區(qū)。4月下旬利用汁液摩擦接種病毒，檢測(cè)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的抗病效果。溫室及大田試驗(yàn)均設(shè)2次重復(fù)。

1.2.4 農(nóng)藝性狀分析

轉(zhuǎn)基因浙密2號(hào)西瓜田間試驗(yàn)主要對(duì)供試材料長(zhǎng)勢(shì)、生物學(xué)性狀、含糖量、越冬能力以及產(chǎn)量等各項(xiàng)農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因的飄移

取轉(zhuǎn)基因西瓜試驗(yàn)區(qū)內(nèi)其它植株80個(gè)樣品，對(duì)其進(jìn)行PCR分析，結(jié)果沒(méi)有擴(kuò)增出WMV-2外殼蛋白基因的特異性條帶。取轉(zhuǎn)基因西瓜試驗(yàn)區(qū)10 m外其它植株60個(gè)樣品，對(duì)其進(jìn)行PCR分析，沒(méi)有擴(kuò)增出WMV-2CP基因的特異性條帶。取轉(zhuǎn)基因西瓜試驗(yàn)區(qū)20 m外普通西瓜植株30個(gè)樣品，對(duì)其進(jìn)行PCR分析，3個(gè)樣品擴(kuò)增出WMV-2外殼蛋白基因的特異性條帶。取轉(zhuǎn)基因西瓜試驗(yàn)區(qū)100 m外普通西瓜植株30個(gè)樣品，對(duì)其進(jìn)行PCR分析，沒(méi)有擴(kuò)增出WMV-2外殼蛋白基因的特異性條帶。

可見(jiàn)，本試驗(yàn)為了防止目的基因擴(kuò)散而采取的100 m內(nèi)種植高桿植物，或以河流和建筑物隔離以防外源基因擴(kuò)散的措施是有效的。

2.2 轉(zhuǎn)基因西瓜WMV-2CP基因的后代分離

PCR檢測(cè)結(jié)果表明，WMV-2外殼蛋白基因在轉(zhuǎn)基因自交子一代西瓜植株的分離比符合孟德?tīng)?∶1的比例 (表1);由R1代植株自交得到R2代植株的WMV-2外殼蛋白基因的分離結(jié)果也符合孟德?tīng)?∶2的分離比 (表2);R3代轉(zhuǎn)基因株系大部分為WMV-2外殼蛋白基因的純合體 (表3);R4代植株WMV-2外殼蛋白基因的純合度比R3代植株更高 (表4);R5代植株 WMV-2外殼蛋白基因的分離結(jié)果表明R5代植株為WMV-2外殼蛋白基因的純合體 (表5)。通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果分析可知，轉(zhuǎn)WMV-2CP基因西瓜的病毒抗性為顯性單基因遺傳，即轉(zhuǎn)WMV-2CP基因西瓜的WMV-2CP基因?yàn)轱@性單基因遺傳。

表1 轉(zhuǎn)基因R1代植株WMV-2CP基因的分離

表2 轉(zhuǎn)基因R2代植株WMV-2CP基因的分離

表3 轉(zhuǎn)基因R3代植株WMV-2CP基因的分離

表4 轉(zhuǎn)基因R4代植株WMV-2CP基因的分離

表5 轉(zhuǎn)基因R5代植株WMV-2CP基因的分離

2.3 轉(zhuǎn)WMV-2CP基因西瓜病毒抗性

抗病性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照植株接種西葫蘆病葉汁液后，主要表現(xiàn)為花葉，頂部葉片出現(xiàn)濃、淡相同的綠色斑駁，病葉細(xì)窄、皺縮，植株矮小、萎縮，花器發(fā)育不良，不易坐果，即使結(jié)果，瓜也較小，接種的20株對(duì)照株平均單果重僅4.1 kg。而轉(zhuǎn)基因 R1、R2、R3、R4、R5代植株 (各 30株，T7、T11和T32各10株)接種西葫蘆病葉汁液后發(fā)病時(shí)間明顯遲于對(duì)照株。轉(zhuǎn)化株T7平均接毒后45 d開(kāi)始發(fā)病，轉(zhuǎn)化株T11平均接毒后40 d開(kāi)始發(fā)病，而轉(zhuǎn)化株T32平均接毒后65 d才開(kāi)始出現(xiàn)病癥，表現(xiàn)出對(duì)WMV-2的高度抗性，30株轉(zhuǎn)化株都能正常開(kāi)花結(jié)果。

將轉(zhuǎn)基因西瓜3個(gè)株系的第5代植株進(jìn)行病毒接種，觀察接毒情況和病情發(fā)展。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的T5代株系于3葉期人工接種 WMV-2，接種后20 d開(kāi)始調(diào)查發(fā)病情況，接種40 d左右達(dá)到發(fā)病高峰 (表6)。另外，西瓜采收時(shí)選取12株抗病性和農(nóng)藝性狀好的單瓜繁殖下一代 (T7、T11、T32各4株)，抗病毒鑒測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)化株可以大大延緩發(fā)病時(shí)間，減輕發(fā)病程度。

表6 接種后40 d轉(zhuǎn)基因R5代植株發(fā)病情況

2.4 轉(zhuǎn)WMV-2CP基因陽(yáng)性西瓜植株長(zhǎng)勢(shì)、生物學(xué)性狀、含糖量及越冬能力

觀察結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因西瓜與未轉(zhuǎn)基因植株在長(zhǎng)勢(shì)、生物學(xué)性狀以及含糖量之間沒(méi)有明顯的差異，其越冬能力和農(nóng)藝性狀也沒(méi)有明顯差異。

2.5 產(chǎn)量分析

與未轉(zhuǎn)基因西瓜植株相比，不同的轉(zhuǎn)基因株系的瓜數(shù)、單瓜重以及產(chǎn)量均有不同程度的提高。其中株系R5T32瓜數(shù)較對(duì)照增加17.26%，單瓜重增加41.95%，產(chǎn)量增加18.86%(表7)。

表7 轉(zhuǎn)基因西瓜產(chǎn)量的變化

3 小結(jié)和討論

由以上的試驗(yàn)結(jié)果可知:轉(zhuǎn)WMV-2CP基因浙密2號(hào)西瓜的抗西瓜花葉病毒的能力，相比浙密2號(hào)有顯著的提高，其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系 T32效果最好。其它陽(yáng)性株系的農(nóng)藝性狀與對(duì)照相比有一定的提高，但沒(méi)有顯著差異。因此，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步食品及環(huán)境安全性評(píng)價(jià)，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系T32可進(jìn)行生產(chǎn)性試驗(yàn)和推廣應(yīng)用。

［1］王慧中，趙培潔，周曉云.農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因西瓜植株 ［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2000，26(1):111－113.

［2］Rogers S O，Bendich A J.Extraction of DNA from milligram amounts of fresh，herbarium and mummified plant tissues［J］.Plant Mol Biol，1985(5):69 －76.

［3］劉俊君，彭學(xué)賢，莽克強(qiáng).大豆花葉病毒基因組3′-端區(qū)域的克隆和序列分析 ［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1992，9(3):201－204.

［4］Francing W.Purification and identification of a South African isolate of watermelon mosaic virus-Moroccs［J］.Phytopathology，1987，120:255－270.