骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液對小鼠卵母細胞的孤雌激活作用

馮定慶，周穎，李彩榮，高婷，凌斌，

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院分子醫(yī)學重點實驗室，合肥 230001; 2.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230001)

研究報告

骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液對小鼠卵母細胞的孤雌激活作用

馮定慶1，周穎1，李彩榮1，高婷2，凌斌1，2

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院分子醫(yī)學重點實驗室，合肥 230001; 2.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230001)

目的研究骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)條件培養(yǎng)液對小鼠M II卵母細胞的孤雌激活作用及胚胎發(fā)育能力。方法分離、培養(yǎng)小鼠MSC，獲取MSC條件培養(yǎng)液(conditioned medium of MSC，CM)。通過促排技術(shù)獲取小鼠MII卵母細胞，分別采用CM、7%乙醇、IVF方法激活，體視顯微鏡下觀察原核形成及囊胚形成率。在CM激活后不同時間點，利用α/β－tubulin抗體標記紡錘體，激光共聚焦顯微鏡下觀察有/無細胞松弛素B(CB)存在時紡錘體的運動變化。結(jié)果CM可以激活小鼠MII卵母細胞，最佳刺激時間為40 min，激活率達到95.4%，囊胚形成率為62%，與7%乙醇組比較無顯著差異，但明顯低于IVF組(95.4%vs.100%;62%vs. 88%，P＜0.01)。CB可以抑制紡錘體的旋轉(zhuǎn)，阻止第二極體的排出，促進二倍體孤雌胚形成，提高囊胚形成率(62%vs.9%，P＜0.01)。結(jié)論CM能有效激活小鼠M II卵母細胞并促進孤雌發(fā)育。

間充質(zhì)干細胞;卵母細胞;孤雌激活;細胞松弛素B

注:A. CM處理40 min后;B.CM激活后CB處理2 h;C. CM激活后CB處理4 h;D.異常紡錘體圖1CM激活卵母細胞的紡錘體運動(標尺= 20 μm)Note: A. 40 min after CM treatment; B. 2 h after CB treatment following activation; C. 4 h after CB treatment following activation; D. abnormal mitotic sPindle comPleXeFig.1Dynamic changes of the sPindle comPleXes of CM activated oocytes (Scale bar = 20 μm)

卵母細胞的孤雌激活是核移植的關(guān)鍵技術(shù)，也是研究哺乳動物孤雌生殖及受精機制的重要手段之一。引起卵母細胞激活的因素很多，通?？煞譃槲锢泶碳ず突瘜W刺激兩類。前者有電刺激和溫度刺激等［1］;后者常用的試劑有乙醇、離子霉素、放線菌酮(CHX)、二甲基氨基嘌呤(DMAP)、Ca2+載體等［2－4］。不同的激活方法和激活劑的選擇，對卵母細胞的孤雌激活率、卵裂率及胚胎發(fā)育均有較大程度的影響。

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一種存在于骨髓內(nèi)的成體干細胞，除了具有自我更新和多向分化潛能外，還可以分泌EGF、LIF、TGF－β、FGF－2、VEGF、MCP－1等多種細胞因子，發(fā)揮營養(yǎng)作用，參與構(gòu)成造血微環(huán)境［5，6］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，MSC條件培養(yǎng)液(CM)能夠促進小鼠體外培養(yǎng)的卵泡發(fā)育，卵母細胞核漿同步成熟，提高成熟率和卵母細胞質(zhì)量［6］。進一步研究顯示，成熟卵母細胞長時間暴露于CM中有激活及卵裂現(xiàn)象的發(fā)生。為了探討最佳激活條件及激活效率，本實驗將小鼠MII卵母細胞用CM處理不同時間，觀察激活效率及孤雌胚胎發(fā)育情況，從而對CM孤雌激活作用做出評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級昆明種小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，來源于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心【SCXK(皖) 2005－001】，并按動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。其中，雌鼠82只用于促排獲取MII卵母細胞和MSC，雄鼠6只用于獲取精子進行體外受精。動物自由攝食，維持8:00～20:00光照循環(huán)，室溫20～25℃，濕度40%～60%。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM、胎牛血清(FCS，Gibco，美國)，HTF (LifeGlobal，美國)，M16、透明質(zhì)酸酶、細胞松弛素B (CB)，α/β－tubulin抗體均購自美國Sigma公司，蛋白酶E(BioShare，德國)，Percoll(Amersham Bioscience，瑞典)，F(xiàn)ITC－anti－CD11b、FITC－anti－CD34、PE－cy5－anti－CD44、PE－anti－CD105(eBioscience，美國)，HCG、PMSG(杭州動物藥品廠，中國)，4孔培養(yǎng)板(Nunc，Roskilde，丹麥)，流式細胞儀(FACS，美國Beckman)，SZX7體視顯微鏡、恒溫載物臺(Olympus，日本)，激光共聚焦顯微鏡(LSM510，德國Zeiss)。

1.3 M SC分離、鑒定及條件培養(yǎng)液的獲取

頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取出股骨和肱骨，PBS反復沖洗骨髓腔;收集沖洗液緩慢加到60%Percoll液面上，2000 r/m in離心20 m in;收集單個核細胞，PBS洗滌2次后用含10%FCS的DMEM重懸，5×106細胞/m L密度接種培養(yǎng)瓶，3 d后換液棄去未貼壁細胞，獲得原代MSC，CD11b、CD34、CD44、CD105標記細胞，F(xiàn)ACS鑒定。F1代MSC 90%鋪滿瓶底時換液，培養(yǎng)48 h后收集上清即為CM，0.22 μm濾膜過濾即用。

1.4 M II卵母細胞獲取及激活

雌鼠腹腔注射PMSG 7.5 IU，48 h后注射HCG 7.5 IU;14 h后處死小鼠，分離雙側(cè)輸卵管放入37℃預(yù)溫的M16培養(yǎng)基內(nèi)，體視顯微鏡下針頭刺破輸卵管壺腹部，獲得卵丘－卵母細胞復合體(COCs); 0.1%透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細胞，HTF洗滌后用于激活處理。

卵母細胞的激活分別采用三種方法:①CM，MII卵母細胞用新鮮收獲的CM處理0 m in、10 m in、40 m in、1 h、2 h;含10%FCS DMEM處理的MII卵母細胞設(shè)為試劑對照;②7%乙醇，MII卵母細胞用含7%乙醇的CZB培養(yǎng)基刺激6 min;③體外受精(IVF)，從雄性小鼠獲取精子，獲能1～1.5 h后，調(diào)整精子密度為0.7×106～1.3×106精子/m L，與用0.5%蛋白酶E去除透明帶的MII卵母細胞進行體外受精。

CM和乙醇激活的卵母細胞用7.5 μg/m L CB處理4 h，然后所有激活的卵母細胞用含0.4%BSA的CZB培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，觀察胚胎發(fā)育情況。其中，48 h時向培養(yǎng)基內(nèi)添加終濃度為1 mmol/L的谷氨酰胺和5.56 mmol/L的葡萄糖。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察紡錘體運動

收獲激活后0、1、2、4、6、12、16、20、24 h的卵母細胞，3.7%多聚甲醛固定30 min放入封閉液(含1%BSA、2%山羊血清、0.1 mol/L甘氨酸、0.01% Triton X－100、0.2%疊氮鈉)內(nèi)4℃保存;α/β－tubulin抗體37℃孵育1 h，F(xiàn)ITC標記二抗作用45 min，然后10 μg/m L PI孵育10 min，其間每步均用0.1% PVP/PBS洗滌;最后70%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 M SC的形態(tài)特征及表型

密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法可以獲得純度很高的MSC，原代培養(yǎng)3d換液可見貼壁細胞呈梭形、紡錘形，增殖迅速，傳代后形態(tài)更為均一。FACS檢測，MSC表型為:CD11b－，CD34－，CD44+，CD105+，與MSC公認表型特征一致(參見前期結(jié)果，文獻6)。

2.2 CM對M II卵母細胞的激活作用

CM處理10 min后46.5%的卵母細胞被激活，而處理40 m in、1 h、2 h激活率均為95%左右，但是隨著時間延長，胚胎碎片的數(shù)目顯著增加。因此，CM最佳作用時間為40 m in。與乙醇組比較激活效率無明顯差異;兩組與IVF組比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01。試劑對照組有6.3%的卵母細胞自發(fā)激活，MII卵母細胞自發(fā)激活常見于低等脊椎動物和兩棲動物［7］，因此后續(xù)實驗未予以分析。見表1。

表1 不同方法對小鼠M II卵母細胞的激活效率比較Tab.1 Activation rate of mouse MII oocytes treated by different protocols

2.3 不同激活方法對胚胎發(fā)育的影響

CM激活的卵母細胞經(jīng)CB處理后，80%形成2個原核，未加CB組大多數(shù)形成1個原核或快速發(fā)生卵裂;CB對激活率無明顯影響(97.2%vs. 95.4%)，但囊胚形成率差異顯著(62%vs.9%，P＜0.01)。CM、7%乙醇激活的MII卵母細胞經(jīng)CB處理后，囊胚形成率均為62%左右，顯著低于IVF組(62%vs.88%，P＜0.01)。見表2。

表2 不同激活方法對小鼠胚胎發(fā)育的影響Tab.2 The effect of different treatments on the development of mouse embryos

2.4 CM活化的卵母細胞紡錘體的運動變化

MII卵母細胞受CM作用40 min后恢復減數(shù)分裂，紡錘體平行于細胞膜，染色質(zhì)排列在赤道板上(圖1A);未加CB處理，紡錘體發(fā)生旋轉(zhuǎn)，活化1～2 h后與細胞膜垂直，染色質(zhì)被拉到兩極，隨后排出第二極體;經(jīng)過CB處理，減數(shù)分裂的恢復和姊妹染色體分離不受影響，但紡錘體運動被抑制，不能排出第二極體(圖1B);CB作用4 h后形成2個原核(圖1C)。但是CM活化的卵母細胞無論是否經(jīng)CB處理，8%左右1－細胞胚胎形成異常紡錘體，如3極或4極紡錘體、中心小體異位、染色質(zhì)排列紊亂等(圖1D)。圖1見彩插4。

3 討論

哺乳動物卵母細胞的激活是生殖過程、IVF、ISCI及核移植技術(shù)成功實施的關(guān)鍵因素之一，其中卵母細胞的孤雌激活更是為克隆研究、父源與母源基因組在胚胎發(fā)育中的作用、印記基因的表達及胚胎干細胞的獲取創(chuàng)造了條件。目前，已經(jīng)建立了多種物理的、化學的人工激活方法［1－4］，但是關(guān)于間充質(zhì)干細胞CM液對卵母細胞的激活作用尚未見報道。

MSC通過旁分泌/自分泌作用分泌一系列細胞因子，在局部發(fā)揮重要的生物學作用，包括抑制局部免疫反應(yīng)、阻止纖維化形成、抑制細胞凋亡、促進血管形成、刺激組織細胞/干細胞有絲分裂和分化參與內(nèi)源性修復［5］。大量的研究發(fā)現(xiàn)，其中的一些因子能夠直接促進卵母細胞發(fā)育成熟，提高胚胎發(fā)育能力，有些就存在于卵泡液中由卵母細胞和顆粒細胞共同分泌［8，9］;我們前期的研究結(jié)果也證實了這一點［6］。LIF有促進很多動物孤雌胚/IVF胚胎原核形成及分裂發(fā)育、提高內(nèi)細胞群數(shù)量等作用［10－12］。在卵泡發(fā)育的各個階段，卵母細胞和顆粒細胞持續(xù)表達EGF受體;O’Donnell等［13］報道，EGF、TGF－α與EGF受體結(jié)合使受體胞內(nèi)部分發(fā)生磷酸化，可以提高卵母細胞胞質(zhì)［Ca2+］i水平，增加細胞通透性，這是卵母細胞活化最重要的早期事件［14］。我們的結(jié)果顯示，CM可以有效激活小鼠MII卵母細胞，最佳刺激時間為40 m in，激活效率達到95%左右;隨著刺激時間延長，激活效率不再增加，而胚胎內(nèi)碎片的數(shù)量卻明顯增加;囊胚形成率為62%，與7%乙醇組比較均無顯著差異。MII卵母細胞用含10%FCS的DMEM處理，也有6.3%左右發(fā)生活化，但是均不能發(fā)育到囊胚階段，我們認為是自發(fā)性活化，這在低等脊椎動物和兩棲動物較為常見，并且老化的卵母細胞更易發(fā)生［7］。

CB是一種促進微絲解聚藥物，可以抑制胞質(zhì)分裂和紡錘體的旋轉(zhuǎn)運動，阻止第二極體的排出，但不影響姊妹染色體的分離，被廣泛用于克隆、獲取二倍體或多倍體胚胎［15］。CM激活MII卵母細胞后，用7.5 μg/m L CB處理4 h，所形成的基本上為二倍體孤雌胚，否則多為單倍體;后者卵裂速度明顯快于二倍體孤雌胚，但是囊胚形成率顯著低下(9%vs. 62%)。在CM激活組，不論CB處理與否，約有8%左右1－細胞胚胎出現(xiàn)異常紡錘體，有的還形成假紡錘體結(jié)構(gòu)，具體原因還不清楚。

上述實驗結(jié)果顯示，CM能夠有效激活MII卵母細胞，即恢復減數(shù)分裂、原核形成并發(fā)育至囊胚。但是CM成分復雜，闡明具體的作用機制及其在核移植、獲取無倫理爭議的胚胎干細胞等領(lǐng)域的應(yīng)用，還需要進一步的研究。

(本文圖1見彩插4。)

［1］Fissore RA，Robl JM.Intracellular Ca2+response of rabbit oocytes to electrical stimulation［J］.Mol Reprod Dev，1992，32:9－16.

［2］Yang X，Presicce GA，Moraghan L，et al.Synergistic effect of ethanol and cycloheximide on activation of freshly matured bovine oocytes［J］.Theriogenology，1994，41:395－403.

［3］Ma SF，Liu XY，Miao DQ，et al.Parthenogenetic activation of mouse oocytes by strontium chloride:a search for the best conditions［J］.Theriogenology，2005，64:1142－1157.

［4］Yi YJ，Park CS.Parthenogenetic development of porcine oocytes treated by ethanol，cycloheximide，cytochalasin B and 6－dimethylaminopurine［J］.Anim Reprod Sci，2005，86:297－304.

［5］Cap lan AI，Dennis JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators［J］.J Cell Biochem，2006，98:1076－1084.

［6］Ling B，F(xiàn)eng DQ，Zhou Y，et al.Effect of conditioned medium of mesenchymal stem cells on the in vitro maturation and subsequent development of mouse oocyte［J］.Braz J Med Biol Res，2008，41:978－985.

［7］Krivokharchenko A，Popova E，Zaitseva I，et al.Development of parthenogenetic rat embryos［J］.Biol Reprod，2003，68:829－836.

［8］Sutton ML，Gilchrist RB，Thompson JG.Effects of in－vivo and in－vitro environments on the metabolism of the cumulus－oocyte complex and its influence on oocyte developmental capacity［J］. Hum Reprod Update，2003，9:35－48.

［9］Chian RC，Buckett WM，Tan SL.In－vitro maturation of human oocytes［J］.Reprod Biomed Online，2004，8:148－166.

［10］Tsai HD，Chang CC，Hsieh YY，et al.Recombinant human leukemia inhibitory factor enhances the development of preimplantation mouse embryo in vitro［J］.Fertil Steril，1999，71:722－725.

［11］Dunglison GF，Barlow DH，Sargent IL.Leukaemia inhibitory factor significantly enhances the blastocyst formation rates of human embryos cultured in serum－free medium［J］.Hum Reprod，1996，11:191－196.

［12］Ptak G，Lopes F，Matsukawa K，et al.Leukaemia inhibitory factor enhances sheep fertilization in vitro via an influence on the oocyte［J］.Theriogenology，2006，65:1891－1899.

［13］O’Donnell JB Jr，Hill JL，Gross DJ.Epidermal growth factor activates cytosolic［Ca2+］elevations and subsequent membrane permeabilization in mouse cumulus－oocyte complexes［J］. Reproduction，2004，127:207－220.

［14］Tomashov－Matar R，Tchetchik D，Eldar A，et al.Strontiuminduced rat egg activation［J］.Reproduction，2005，130:467－474.

［15］Zhu ZY，Chen DY，Li JS，et al.Rotation of meiotic spindle is controlled by microfilaments in mouse oocytes［J］.Biol Reprod，2003，68:943－946.

Effects of Conditioned M edium of M esenchym al Stem Cells on M ouse Oocyte Parthenogenetic Activation

FENG Ding－qing1，ZHOU Ying1，LI Cai－rong1，GAO Ting2，LING Bin1，2
(1.Anhui Province Key Laboratory of Molecular Medicine，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China)

ObjectiveTo investigate the effects of conditioned medium of mesenchymal stem cells(CM)on the parthenogenetic activation and development of mouse MII oocytes.MethodsMouse mesenchymal stem cells(MSC)were isolated and further cultured to collect CM.Mouse MII oocytes were collected with superovulation and activated with CM，7%ethanol，or in vitro fertilization(IVF)，respectively.Pronuclei formation and embryo development were evaluated under the view of a stereomicroscope.At various time－points after activation with or without the presence of cytochalasin B (CB)，the dynamic changes of meiotic spindle，as visualized in preparations stained for α/β－tubulin and chromatin，were observed by fluorescent confocal microscopy.ResultsCM effectively activated MII oocytes with the optimal time of 40 min.The rates of activation and blastocyst showed no significant difference between CM and 7%ethanol but were significantly lower in both compared with that in the IVF group(95.4%vs.100%，P＜0.01;62%vs.88%，P＜0.01).CB inhibited the spindle rotation and polar body extrusion but did not affect chromosomal movement and nuclear division and，thus，facilitated the diploid formation and blastocyst rate(62%vs.9%，P＜0.01).ConlusionCM is an effective medium for mouse MII oocyte activation and subsequent embryo development.

Mesenchymal stem cell;Oocyte;Parthenogenetic activation;Cytochalasin B;Mouse

Q－813.7

A

1005－4847(2010)04－0304－04

2009－09－03

國家自然基金(編號:34071805，30901606);安徽省科技攻關(guān)項目(編號:06013124B)。

馮定慶(1977－)，男，助理研究員，碩士;研究方向:生殖免疫。E－mail:feng.dingqing@gmail.com

凌斌。E－mail:lingbin.ling@gmail.com