蜂王漿中糠氨酸含量測定及其對新鮮度的影響

彭 瑜 陳 坤 徐錦忠 林德祥 何騰飛 吉 翔 王曉平

（1南京老山藥業(yè)股份有限公司，南京211800；2江蘇省蜂業(yè)工程技術(shù)研究中心，南京211800）

新鮮蜂王漿中含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，促進(jìn)組織再生等作用。由于蜂王漿中的一些活性成分對溫度和儲存時間敏感，因而蜂王漿對貯存條件要求較高，若貯存溫度過高或貯存時間過長，其物理性狀、化學(xué)成分及其品質(zhì)會發(fā)生顯著變化?，F(xiàn)行的蜂王漿國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 9697-2005)中規(guī)定蜂王漿品質(zhì)的指標(biāo)癸烯酸非常穩(wěn)定，即使在高溫下也不會大量分解，不適合作為蜂王漿新鮮度以及品質(zhì)的指標(biāo)，只能作為蜂王漿是否摻假的評判標(biāo)準(zhǔn)。研究表明[1-3]，糠氨酸可以作為蜂王漿新鮮度的標(biāo)示物?？钒彼崾怯⑽膄urosine的中文譯名，按照“國際純粹和應(yīng)用化學(xué)化合物系統(tǒng)命名法”,其學(xué)名是ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸。

美拉德反應(yīng)(MaillardReaction)是食品中的氨基化合物（胺、氨基酸、肽和蛋白質(zhì)）和羰基化合物（糖類）在食品加工和貯存過程中自然發(fā)生的反應(yīng)。從營養(yǎng)學(xué)角度考慮，由于反應(yīng)使食品中的有效成分如氨基酸類和糖類有損失以及引起食品的褐變等，從而使食品的營養(yǎng)價值部分降低。蜂王漿在加工和儲藏過程中，由于發(fā)生美拉德反應(yīng)，不僅其營養(yǎng)物質(zhì)受到破壞，還產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì),糠氨酸是美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的系列產(chǎn)物之一，攝入過量對人體健康有害。

本研究運用蜂王漿美拉德反應(yīng)機(jī)理，以美拉德反應(yīng)重要產(chǎn)物、糖基化反應(yīng)非常靈敏的指標(biāo)“糠氨酸”為標(biāo)示物，以其在蜂王漿中含量的變化來研究蜂王漿凍干粉的新鮮度。

1 試驗材料與方法

1.1原理 美拉德反應(yīng)(MaillardReaction)使食品中的有效成分如氨基酸類和糖類有所損失并引起食品的褐變等，使食品的營養(yǎng)價值部分降低，在加工和儲藏蜂王漿及其制品過程中，由于發(fā)生美拉德反應(yīng)，使其營養(yǎng)物質(zhì)受到破壞并產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)。國內(nèi)外大量文獻(xiàn)表明Furosine是反應(yīng)初級階段主要產(chǎn)物之一，也是在常溫或低溫條件下美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物，能夠反映早期美拉德反應(yīng)的程度，已被作為很多食品如乳制品等在常溫下貯存的貨架期指標(biāo)。本項目Furosine含量利用高效液相色譜（HPLC）紫外檢測器在280nm處檢測，外標(biāo)法定量。

1.2 儀器器皿 高效液相色譜儀（Agilent 1100），AgilentCo.Ltd；C18色譜柱 (Kromasil-100A-Spherical Silica，Serial NO B450j1114313)； 鼓 風(fēng) 干 燥 箱 ：Binder；氮氣吹干儀：NENVAP111.Berlin，MA01503 U.S.A；20 孔固相萃取裝置：Agilent Technologies；蛋白質(zhì)測定儀：2300 Kjeltec Analyzer Unit；C18孔固相萃小柱：Supelclean LC-18 SPE Tubes 3 ml.Supelco；帶螺蓋耐熱水解瓶，Waters.

1.3試劑 除另有說明，其他均為分析純。乙腈（色譜純）；甲醇；超純水；濃鹽酸；0.1%三氟乙酸溶液：將1mL三氟乙酸（色譜純）溶于1000 mL水中，用0.45 um濾膜減壓過濾。Furosine標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取2.00 mg Furosine標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 3.0 mol/L鹽酸溶液中配置成200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4℃下可保存24個月），分析時取標(biāo)液1.0 mL，用水定容至10 mL，配置成10μg/mL的furosine溶液。

1.4 樣品前處理和測定 由于Furosine在蜂王漿中是以蛋白結(jié)合態(tài)的形式存在的，要測定它，就必須通過水解使Furosine從蜂王漿蛋白質(zhì)中游離出來。準(zhǔn)確稱取0.35g（精確到0.0001 g）蜂王漿，加入10mL 10mol/L鹽酸溶液，搖勻，通氮氣2min，蓋緊螺蓋，于110℃烘箱內(nèi)水解23小時后，冷卻，過濾，濾液作為待測溶液。

1.5蛋白質(zhì)的測定 取0.5 g蜂王漿（精確到0.001 g），加入催化劑，加入14 mL 98%濃硫酸水解后用凱氏定氮儀測定。

1.6糠氨酸的測定

1.6.1 純化 取0.5mL水解待測溶液過C18固相萃取小柱（萃取柱預(yù)先用5mL甲醇和10mL水潤濕，并保持水面在固相表面），當(dāng)液面降至固相表面時，加入3 mL 3.0mol/L鹽酸溶液洗脫，收集3mL洗脫液為HPLC上機(jī)試液。固相萃取過程中控制流速為1～2滴/s。

1.6.2 HPLC測定 色譜柱：C18 (Kromasil-100ASpherical Silica，Serial NO B450j1114313); 柱 溫：20℃;檢測波長：280nm；流動相由0.1%三氟乙酸和乙腈組成，在流速0.7mL/min下以梯度方式進(jìn)行洗脫，梯度程序見表1。

進(jìn)樣量：20uL，外標(biāo)法定量。

1.7結(jié)果計算 蜂王漿樣品中糠氨酸含量w計算：

表1 流動相梯度洗脫程序

式中,w為樣品中糠氨酸的含量(mg/100g pro)；c為HPLC測得的樣品水解液中糠氨酸含量（ug/m L）；D為HPLC測定時樣品溶液稀釋倍數(shù)；m為樣品水解液中蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.8試驗結(jié)果與討論

1.8.1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品HPLC測定 糠氨酸出峰時間在7～9min。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品HPLC測定結(jié)果見圖1和圖2。

1.8.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 配置 0.1、0.25、1.0、2.5、5.0、

10.0、25 .0 μg/mL Furosine標(biāo)準(zhǔn)溶液，以其峰面積（Y）對濃度(X，μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，r=0.99996，表明 furosine在 0.1μg/mL～25 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。平均相對偏差（RSD）＜5%(N=10)。

1.8.3 回收率測定 標(biāo)準(zhǔn)加入法回收率測定為92.5%～105.0%，平均為98.7%。

2 糠氨酸含量對蜂王漿新鮮度的影響研究

為了系統(tǒng)全面地檢測蜂王漿受多因素影響下Furosine含量的變化和相關(guān)性，現(xiàn)場采集了批號為070606江浦和六合兩地各五個蜂場的新鮮蜂王漿，在不同儲存溫度和時間因素影響下研究其Furosine含量的變化和相關(guān)性。經(jīng)過一年的研究，發(fā)現(xiàn)其Furosine含量（每次檢測取樣為兩地的五個蜂場分別各取2份混勻后的樣品，測算10份樣品的平均值，）隨著時間的增長而提高，并且儲存溫度越高，含量越高。如下圖4和圖5所示。

3 討論

經(jīng)過現(xiàn)階段蜂王漿新鮮度研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)urosine含量隨著時間的增長而提高，并且儲存溫度越高，含量越高。因此，用Furosine含量能夠有效地反映蜂王漿的新鮮度，可以作為評價蜂王漿新鮮度的一個重要指標(biāo)。由于本研究僅對兩地區(qū)共十個蜂場的意蜂產(chǎn)的蜂王漿做了研究比較，有待于對不同產(chǎn)地、季節(jié)、蜂群的蜂王漿作進(jìn)一步研究，以確定Furosine是否真正適合作為評價蜂王漿新鮮度的指標(biāo)。

[1]EMANUELE MARCONI,*MARIA FIORENZA CABONI,MARIA CRISTINA MESSIA,GIANFRANCO PANFILI，F(xiàn)urosine：a Suitable Marker for Assessing the Freshness of Royal Jelly，J.Agric.Food Chem.2002,50,2825-2829。

[2]Asylbek KULMYRZAEV，éric DUFOUR，Determination of lactulose and furosine in milk using front-face fluorescence spectroscopy，Lait 82(2002)725-735。

[3]鄭火青，胡福良，李英華．蜂王漿新鮮度指標(biāo)的研究進(jìn)展[J]．中國養(yǎng)蜂．2005．56(1 1)：30-31．