大鼠間歇訓(xùn)練對海馬 c-fos蛋白表達(dá)的影響

于 芳,張安民,李 楠

大鼠間歇訓(xùn)練對海馬 c-fos蛋白表達(dá)的影響

于 芳1,張安民2,李 楠3

(1.中北大學(xué)體育系,山西太原 030051;2.煙臺(tái)大學(xué)體育學(xué)院,山東煙臺(tái) 264005;3.山西醫(yī)科大學(xué),山西太原 030001)

為了觀察大鼠間歇訓(xùn)練對海馬 c-fos蛋白表達(dá)的影響。將雄性 SD大鼠 30只,隨機(jī)分為對照組(5只)、間歇訓(xùn)練組(25只)。建立大鼠間歇游泳訓(xùn)練模型,采用ABC免疫組織化學(xué)法,觀察大鼠海馬 c-fos陽性神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)的變化(即 c-fos蛋白表達(dá)變化),并用圖像分析系統(tǒng)和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明:訓(xùn)練后大鼠海馬不同區(qū)域 c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)密度明顯增高,與對照組相比均有顯著性差異 (P<0.01);CA2區(qū) c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)迅速而明顯,訓(xùn)練后 0.5 h即達(dá)峰值,而后回落;CA3區(qū) c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)最為密集,訓(xùn)練后 1 h達(dá)到高峰,而后快速回落; CA1區(qū) c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)相對較少,1 h達(dá)到高峰,而后緩慢下降。結(jié)論:大鼠間歇訓(xùn)練對海馬不同區(qū)域 c-fos蛋白表達(dá)有影響,具有時(shí)效性;海馬不同區(qū)域 c-fos蛋白表達(dá)在密度、時(shí)相上存在明顯差異,這可能與海馬不同區(qū)域?qū)θ毖?、缺氧的耐受能力有關(guān)。

間歇訓(xùn)練;海馬;c-fos蛋白

海馬是下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸 (HPA)應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞。海馬在抑制下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸 (HPA)的應(yīng)激反應(yīng)中起著非常重要的作用。刺激海馬可抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素的分泌,損傷整個(gè)海馬或海馬背側(cè),則可引起HPA軸對多種應(yīng)激源的敏感性增強(qiáng),血漿糖皮質(zhì)濃度異常升高[1]。據(jù)此,Fuchs提出邊緣系統(tǒng)—下丘腦—垂體—腎上腺軸 (HLPA)[2]的概念,因此,作為邊緣系統(tǒng)的海馬就更受關(guān)注。旨在通過觀察 6周間歇性負(fù)重游泳訓(xùn)練后,大鼠海馬內(nèi) c-fos表達(dá)的分布特點(diǎn)、隨時(shí)間變化的規(guī)律,探討間歇訓(xùn)練腦變化的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

采用雄性 SD大鼠 (山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),3月齡,體重 220～250 g。飼養(yǎng)條件:分籠飼養(yǎng),每籠 5只,自由飲食,自然晝夜節(jié)律光照,室溫在20±5℃。相對濕度在40%～60%。將大鼠隨機(jī)分為:對照組 5只,間歇訓(xùn)練組 25只。

1.2 訓(xùn)練模型建立

采用游泳訓(xùn)練方式建立訓(xùn)練動(dòng)物模型。游泳條件:塑鋼玻璃游泳池,150×60×70 cm,水深為大鼠身體長度的 2倍,約 60 cm,水溫保持在 33℃至36℃之間,每個(gè)游泳池隨機(jī)分配 5只大鼠。正式訓(xùn)練前訓(xùn)練組大鼠進(jìn)行 3 d適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,3 d的訓(xùn)練時(shí)間分別為 15 min、20 min、30 min。隨后開始正式的游泳訓(xùn)練,訓(xùn)練安排見表 1。

表1 游泳訓(xùn)練安排表

1.3 取材切片

6周間歇游泳訓(xùn)練造模結(jié)束后,分即刻、0.5 h、1 h、2 h、4 h共 5個(gè)時(shí)刻取材。首先用 0.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動(dòng)物 (35～50 mg/公斤體重),打開胸腔,從心尖將穿刺針插入至升主動(dòng)脈,然后迅速剪破右心耳,并快速灌入 400 ml預(yù)冷的生理鹽水沖洗血管,隨后用 4%多聚甲醛 250 ml快速灌注,接著放慢速度仍用 4%多聚甲醛 250 ml灌注,進(jìn)行前固定,然后用 10%蔗糖 PBS液灌入 300 ml,至肝臟變硬變白為止。最后迅速斷頭,將頭部放在冰盤上,打開顱腔,暴露全腦,取出放在 4%多聚甲醛液內(nèi)固定 2 h,再浸入 20%蔗糖 PBS液中 4℃過夜,待組織塊完全沉底后,用冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,隔 4取 1,片厚 40μm。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

切片經(jīng) 0.5%Triton X-100 PBS液孵育 40 min,入H2O2中 10 min,然后加入 10%正常羊血清封閉40 min,再加入第一抗體 (兔抗鼠),37℃孵育 5 h后,4℃再孵育 36 h;隨后加入生物素化羊抗兔第二抗體,37℃孵育 40 min,接著入卵白素生物素復(fù)合物中,37℃孵育 40 min,以上各步驟均用 0.01 M PBS液經(jīng)搖床充分漂洗 3遍 (每次 3～5 min),DAB呈色,用蒸餾水充分漂洗 3次 (每次 3～5 min), 0.2%明膠裱片,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

陰性對照組:分別以正常兔血清和 PBS代替第一抗體孵育,對照組無陽性產(chǎn)物即無特異性反應(yīng)。

1.5 細(xì)胞記數(shù)和定量分析

其免疫陽性物質(zhì)位于細(xì)胞核內(nèi),核深染,呈圓形或橢圓形,核仁透亮不著色,胞漿染色為陰性,無論染色深淺只要所示細(xì)胞為DAB特征染色 (光鏡下 c-fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元呈圓形和橢圓形),免疫陽性物質(zhì)位于細(xì)胞核內(nèi),核深染,核仁透亮不著色,胞漿染色為陰性。在低倍鏡下和高倍鏡下與背景區(qū)分明確,即可認(rèn)定為 FOS樣蛋白免疫反應(yīng)(Fos-like immunreactivity FL I)陽性細(xì)胞核。40×10倍光鏡下計(jì)數(shù)每張切片雙側(cè)海馬的 FL I陽性神經(jīng)元的數(shù)量,應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì) FL I陽性細(xì)胞總數(shù)、均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤,每組內(nèi)各時(shí)段間的差異用方差分析,組間比較用獨(dú)立 t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

光鏡下觀察,大鼠海馬區(qū) c-fos蛋白免疫反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀,染色均勻,主要位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi),胞漿內(nèi)也有部分表達(dá),背底呈淡黃或不著色。

圖象分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示 (見表 2,圖1):正常對照組和模型組大鼠下丘腦內(nèi)均有表達(dá),對照組 c-fos陽性細(xì)胞少量散在大鼠海馬;模型組 cfos陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多。間歇訓(xùn)練結(jié)束后,在大鼠海馬 CA1區(qū)域 c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)較平和,逐漸升高至 1 h達(dá)最高值,而后緩慢回落;CA2區(qū)域 cfos陽性細(xì)胞表達(dá)迅速增加,0.5 h即達(dá)峰值,1h時(shí)較峰值顯著下降 (P<0.05),然后維持在一定水平; CA3區(qū)域 c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)密度持續(xù)升高,訓(xùn)練后 1 h,c-fos陽性細(xì)胞數(shù)密度最大,達(dá)到峰值,較其他各組表達(dá)顯著升高 (P<0.05),2 h后表達(dá)快速下降。

表 2 大鼠海馬 CA1、CA2、CA3區(qū) c-fos陽性神經(jīng)元圖像分析結(jié)果

圖 1 大鼠海馬 CA1、CA2、CA3區(qū) c-fos蛋白表達(dá)的時(shí)效性

3 討論

在原癌基因的家族中有一類能被第二信使所誘導(dǎo)的原癌基因稱為即刻早期基因 ( Immediately Early Genes,IEGs),亦稱快速反應(yīng)基因。這類基因是指細(xì)胞經(jīng)外部刺激后最先表達(dá)的一組基因,是聯(lián)系細(xì)胞生化改變與細(xì)胞最終對刺激發(fā)生特異性反應(yīng)的中介物。因此,又被認(rèn)為是第三信使[3]。c-fos屬于即刻早期基因 (IEG),近幾年來,隨著對生物學(xué)功能認(rèn)識(shí)的逐漸深入,人們開始從不同的角度探討影響原癌基因 c-fos表達(dá)的因素。c-fos基因作為數(shù)十種原癌基因中的一種,在正常情況下參與細(xì)胞的生長、分化、信息傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等生理過程,它通常處于不活動(dòng)或表達(dá)很低的狀態(tài),在受到刺激時(shí)能做出迅速而短暫的反應(yīng) (刺激后數(shù)十分鐘內(nèi)即開始表達(dá),數(shù)十小時(shí)后就恢復(fù)正常水平),被認(rèn)為是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)最有代表性的即刻早期基因[4-5],且其表達(dá)產(chǎn)物 mRNA和核磷蛋白 (P55c-fos,簡稱 Fos)位于神經(jīng)元的胞漿或胞核內(nèi),人們常將其視作神經(jīng)元激活的一個(gè)重要指標(biāo)。再之,不同性質(zhì)和強(qiáng)度刺激時(shí) c-fos表達(dá)的腦區(qū)、時(shí)程、密度和數(shù)量不同,用免疫組織化學(xué)方法顯示在各種刺激條件下 c-fos表達(dá)產(chǎn)物所在腦區(qū)和強(qiáng)度并結(jié)合其時(shí)程變化的特點(diǎn),可對不同刺激在腦內(nèi)的功能定位和神經(jīng)通路進(jìn)行研究[6]。短暫的刺激與長期的表達(dá)變化有著一定的聯(lián)系,這其中需要原癌基因表達(dá)的改變,同時(shí)也必然存在著一種或多種機(jī)制,將細(xì)胞表面刺激與神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)裝置偶聯(lián)起來,從而對細(xì)胞分化和可塑性起著重要作用[7]。近期不少學(xué)者注意到了這一點(diǎn),開始研究應(yīng)激對海馬 c-fos蛋白表達(dá)的影響。

已有研究證實(shí),運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對海馬區(qū)的 c-fos基因表達(dá)有著顯著的影響,Dayas[8]和 Oladehin[9]分別發(fā)現(xiàn)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和游泳均能增加海馬 c-fos基因表達(dá),研究認(rèn)為運(yùn)動(dòng)不僅能維持海馬神經(jīng)元的活性,而且在運(yùn)動(dòng)影響神經(jīng)系統(tǒng)的過程中起到了調(diào)控因子的作用。本研究建立了間歇訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,模擬負(fù)荷強(qiáng)度高、瞬間性強(qiáng)的無氧運(yùn)動(dòng)。選取海馬 CA1區(qū)、CA2區(qū)和 CA3區(qū)為研究腦區(qū),觀察間歇訓(xùn)練后,大鼠海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)和 CA3區(qū) c-fos蛋白表達(dá)規(guī)律,探討不同形式訓(xùn)練腦變化的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:間歇訓(xùn)練后大鼠海馬不同區(qū)域 c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)均顯著升高。其規(guī)律是:間歇訓(xùn)練結(jié)束后,在大鼠海馬 CA1區(qū)域 c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)較平和,逐漸升高至 1 h達(dá)最高值,而后緩慢回落;CA2區(qū)域 c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)迅速增加,0.5 h即達(dá)峰值,1 h時(shí)較峰值顯著下降 (P<0.05),然后維持在一定水平;CA3區(qū)域 c-fos陽性細(xì)胞表達(dá)密度持續(xù)升高,訓(xùn)練后 1 h,c-fos陽性細(xì)胞數(shù)密度最大,達(dá)到峰值,較其他各組表達(dá)顯著升高 (P<0.05),2 h后表達(dá)快速下降。這些結(jié)果提示:1)訓(xùn)練應(yīng)激能使海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的即刻基因信息系統(tǒng)快速激活,使神經(jīng)細(xì)胞處于活化狀,并對與海馬 c-fos蛋白調(diào)節(jié)有關(guān)的下游靶細(xì)胞及信號通路產(chǎn)生較長時(shí)間的影響;2)大鼠海馬 CA1區(qū)、CA2區(qū)和 CA3區(qū)中 c-fos表達(dá)在密度、時(shí)相上均存在明顯差異,這可能與海馬不同區(qū)域?qū)θ毖?、缺氧的耐受能力有關(guān);3)訓(xùn)練應(yīng)激引起海馬 c-fos表達(dá)上調(diào)的機(jī)制可能與NMDA受體的激活和胞內(nèi)鈣離子濃度升高密切相關(guān)。Murphy[10]在腦缺血前應(yīng)用NMDA受體拮抗劑MK-801,結(jié)果發(fā)現(xiàn)能明顯抑制 c-fos基因在腦缺血后的表達(dá),證明NMDA受體參與了 c-fos基因的表達(dá)。也有研究認(rèn)為[11],胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí),與鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合形成 Ca/CaM復(fù)合物,對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化修飾,從而啟動(dòng) c-fos基因的表達(dá)。

目前,對于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后 c-fos表達(dá)的作用尚有爭議,還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。我們的后期實(shí)驗(yàn)將對c-fos的靶基因及效應(yīng)進(jìn)行研究,以揭示運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對機(jī)體影響的中樞機(jī)制。

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[責(zé)任編輯 江國平]

Study of the Influence of Interm ittent Exercise on the Expression of c-fos Protein in Hippocampus of Rat

YU Fang1,ZHANGAn-min2;L INan3
(1.College of Phydical Education,North Uuniversity of China,Shanxi 030051,China; 2.College of Phydical Education,YanTaiUniversity Yantai Shandong 264005,China; 3.MedicalUniversity of Shanxi,Taiyuan 030001,China)

This is to study the effect of inter mittent exercise on the expression of c-fos protein in hippocampus.Male SD rats were randomly divided into two groups:control group and intermittent exercise group.To establish the intermittent s wimming exercise models in rat,and detect the change of the expression of c-fospositive cells in hippocampus by usingABC immunohistochemistrymeans,then analyze the image and data by imaging analyzing system and statistic software.The result shows that: after exercise,the density of c-fos positive cellswere significantly higher in the different regions of hippocampus,with significant difference as comparedwith the control group(P<0.01);in CA2,the expression of c-fospositive cellswere increased obviously,gets up to the top at 05h,and then descend;In CA3,the express density of c-fos positive cells is the highest,the top at 1h,and then descend rapidly;in CA1,the express density of c-fos positive cells is small relatively,the top at 1h,and then descend slowly.Conclusion:inter mittent exercise could affect the expression of c-fos protein in hippocampus,and the expression of c-fos protein was timelines;the express density and phase of c-fos positive cells in the different regions of hippocampus have significant difference due to the tolerance of ischemia and anoxia.

inter mittent exercise;hippocampus;c-fos protein

G 804.2

A

1007-7413(2010)02-0078-04

2009-12-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671019)

于芳(1968—),女,山西太原人,副教授。研究方向:運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。