蘇氨酸三肽與DNA相互作用的研究*

王剛，馬英杰，盧奎

（1.武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢430415；2.河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州450052）

蘇氨酸三肽與DNA相互作用的研究*

王剛1，馬英杰2，盧奎2

（1.武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢430415；2.河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州450052）

利用紫外-可見光譜法和凝膠電泳法研究了在人體正常的生理環(huán)境下蘇氨酸三肽與DNA的相互作用。結(jié)果表明：蘇氨酸三肽可與DNA發(fā)生相互作用，二者的作用模式為溝槽結(jié)合，結(jié)合常數(shù)為K=6.4× 105L·mol-1，最大結(jié)合數(shù)n=7.04。

紫外-可見分光光度法；凝膠電泳法；蘇氨酸三肽；DNA；相互作用

脫氧核糖核酸（DNA）是生物體內(nèi)的重要組成物質(zhì)，是遺傳信息的主要載體。其與生物的生長、發(fā)育和繁殖等密切相關(guān)。小分子可與其發(fā)生相互作用，從而影響人體的生長、發(fā)育和繁殖等，從而小分子可應(yīng)用于生物醫(yī)藥、功能性食品及生命科學(xué)等領(lǐng)域[1，2]。

蘇氨酸是一種重要的營養(yǎng)強化劑，有恢復(fù)人體疲勞，促進生長發(fā)育的效果，并且對保護細(xì)胞膜起重要作用，在體內(nèi)能促進磷脂合成和脂肪酸氧化。其制劑具有促進人體發(fā)育抗脂肪肝藥用效能，是復(fù)合氨基酸輸液中的一個成分。因此，由它們形成的寡肽，也應(yīng)具有巨大的潛在應(yīng)用價值。并且與氨基酸相比，寡肽的吸收速度和效率更高，且其可由腸道不經(jīng)降解直接吸收[3，4]。由此可以推測蘇氨酸形成的寡肽比蘇氨酸本身更易被人體吸收，其可能具有比蘇氨酸更高的生物活性。

因此，為了研究蘇氨酸寡肽在生物醫(yī)藥、功能性食品及生命科學(xué)等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值，考察了蘇氨酸三肽（Thr-Thr-Thr）與DNA的相互作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；紫外凝膠成像儀（美國BIO-RAD（伯樂）公司）。

蘇氨酸三肽參照文獻方法制備[5]，用二次蒸餾水配成濃度為3.490×10-4mol·L-1的溶液；DNA（A. R.Sigma公司，0～4℃保存，用前未作進一步處理，純度以260 nm與280 nm處吸光度的比值檢測（A260/A280=1.872＞1.8，符合實驗要求），利用260 nm處的吸光度確定其濃度（ε=6600 L·（mol·cm）-1）為2.227×10-3mol·L-1；1.0 mol·L-1NaCl溶液；1.0 mol· L-1NaH2PO4溶液；Tris-HCl緩沖溶液（pH值為7.40）。其余試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外-可見吸收光譜法研究Thr-Thr-Thr與DNA的相互作用

（1）分別取配好的DNA溶液、Thr-Thr-Thr溶液、NaCl溶液和NaH2PO4溶液各100μL，用Tris-HCl緩沖液稀釋到10mL，用Tris-HCl緩沖液作參比測定200～400nm的紫外吸收光譜。

（2）Thr-Thr-Thr濃度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響于一系列10 mL比色管中加入相同體積的DNA溶液，一定量的Thr-Thr-Thr溶液，其加入量以一系列Rt（Rt=cThr-Thr-Thr/cDNA，下同）值確定，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度，混勻，于37℃下放置1 h后，以相應(yīng)的Thr-Thr-Thr溶液作參比，進行紫外光譜掃描。

（3）作用時間對Thr-Thr-Thr-DNA紫外光譜的影響于一系列10 mL比色管中，在Thr-Thr-Thr-DNA體系中（Rt＝2），用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，于37℃下放置數(shù)小時后，以相應(yīng)的Thr-Thr-Thr溶液作參比，測定其紫外吸收光譜。

（4）Na+強度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響于一系列10mL比色管中，在Thr-Thr-Thr-DNA體系中（Rt＝2），以NaCl調(diào)節(jié)離子強度，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，于37℃下放置1 h后，以相應(yīng)的Thr-Thr-Thr溶液作參比，測定其紫外吸收光譜。

（5）PO43-濃度對Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響于一系列10 mL比色管中，在Thr-Thr-Thr-DNA體系中（Rt＝2），加入不同濃度的NaH2PO4溶液，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，于37℃下放置1 h后，以Thr-Thr-Thr溶液作參比，測定其紫外吸收光譜。

（6）結(jié)合常數(shù)的計算采用公式：ΔA-1=（ΔεCL）-1+（ΔεKCL）-1CP-1計算Thr-Thr-Thr與DNA的結(jié)合常數(shù)和最大結(jié)合數(shù)。

2.2.2 凝膠電泳法研究Thr-Thr-Thr與pUC18DNA相互作用向上樣槽中加入1μL pUC18DNA溶液（0.5μg·μL-1），然后加入不同體積的蘇氨酸三肽溶液（0、1、2、3、4、5、6、7、8和91μL），再加入水，使反應(yīng)液終體積保持一致，混合均勻。37℃放置1 h后，加入2μL的上樣緩沖液TBE，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠，穩(wěn)壓80 V，電泳60 min，取出凝膠，使用凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜法

2.1.1 DNA、蘇氨酸三肽（Thr-Thr-Thr）溶液紫外吸收光譜的測定（圖1）

圖1DNA與Thr-Thr-Thr的紫外吸收光譜Fig.1The UV-Vis absorption spectroscopy of DNA and Thr-Thr-Thr（a.DNA b.Thr-Thr-Thr）

對DNA進行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)其在λ＝260nm有最大吸收；Thr-Thr-Thr在260nm附近也有紫外吸收，因此，在紫外光譜法研究Thr-Thr-Thr濃度對Ph-DNA紫外吸收影響時，須用相應(yīng)的Thr-Thr-Thr溶液作參比，以扣除Thr-Thr-Thr在λ＝260nm處的吸收。

2.1.2 蘇氨酸三肽（Thr-Thr-Thr）濃度對DNA紫外光譜的影響（圖2）

圖2Thr-Thr-Thr濃度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外吸收光譜的影響Fig.2UV-Vis absorption spectra of different concentration of Thr-Thr-Thr interacted with DNA

由圖2可知，在Thr-Thr-Thr-DNA體系中，隨著Thr-Thr-Thr的濃度不斷增加，DNA分子在260nm處的紫外吸收呈增色效應(yīng)。在Rt值為0～2階段，增色效應(yīng)較為明顯，增色率較大；在Rt值為2～6階段，增色率不大。

增色效應(yīng)可能是Thr-Thr-Thr以氫鍵作用或范德華力的方式與DNA的大溝或小溝的堿基邊緣直接發(fā)生相互作用，破壞了DNA的雙螺旋而產(chǎn)生的。DNA的堿基是紫外光譜的生色團。在正常情況下，DNA的堿基是被包裹在DNA磷酸骨架內(nèi)部的。磷酸骨架的存在，減弱了堿基的紫外吸收。當(dāng)有外在的物質(zhì)與DNA發(fā)生作用時，外在物質(zhì)破壞了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使得堿基從嚴(yán)密的包裹狀態(tài)下，暴露出來。這將使得DNA的紫外吸收明顯的增加[6]。

然而，在本文中Thr-Thr-Thr的加入會使得DNA的紫外吸收發(fā)生增色效應(yīng)，但增色率不大（在Rt值0～6范圍內(nèi)，約為：8.8%）。這說明可能是Thr-Thr-Thr以溝槽作用的方式與DNA的堿基發(fā)生作用，有限度的改變了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，但沒有從根本上破壞DNA的雙螺旋。

2.1.3 作用時間對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響（圖3）

圖3 時間對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響Fig.3UV-Vis absorption spectra of different interaction time of Thr-Thr-Thr interacted with DNA

隨著時間的延長，Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收發(fā)生增色效應(yīng)。在6h內(nèi)，增色效應(yīng)較為明顯，增色率達到了15.3%；而在其后的8h內(nèi)，Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收的增色效應(yīng)不明顯，增色率僅為2.7%。

可能的原因是：Thr-Thr-Thr與DNA發(fā)生相互作用是動態(tài)的，二者之間的相互作用要達到動態(tài)的平衡是需要一定時間的。這個時間可能就是6h。經(jīng)過6h，Thr-Thr-Thr與DNA的相互作用達到了平衡狀態(tài)，此時Thr-Thr-Thr-DNA體系也就達到了穩(wěn)定的狀態(tài)，體系的紫外吸收也達到了一個較為穩(wěn)定的值。此后，再延長時間，也不會對Thr-Thr-Thr-DNA體系產(chǎn)生影響。因此，Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收也就保持基本恒定。

2.1.4 體系Na+強度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響（圖4）

圖4Na+強度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響Fig.4Effect of salinity on the UV-Vis absorption spectra of Thr-Thr-Thr interaction with DNA

由圖4可知，在0～160mmol·L-1的Na+濃度范圍內(nèi)，隨著Na+濃度的增加，Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收發(fā)生一定的增色效應(yīng)，增色的幅度約為6.3%；當(dāng)Na+濃度從160mmol·L-1增加到200mmol· L-1，Thr-Thr-Thr-DNA體系的體系的紫外吸收有一定程度的降低，降幅約為3%。

以上現(xiàn)象的原因可能是Thr-Thr-Thr使得DNA的立體構(gòu)象發(fā)生改變，當(dāng)然Na+濃度會維持并稍稍加大這一改變。這就使得Thr-Thr-Thr-DNA體系的體系的紫外吸收有一定的增色效應(yīng)；但當(dāng)Na+濃度增加到一定程度時（160 mmol·L-1），由于Na+與DNA的磷酸骨架作用，中和其上所帶的正電荷，使得DNA分子因Thr-Thr-Thr的作用而發(fā)生的構(gòu)象改變，有一定程度的恢復(fù)。這時，Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收，有一定程度的減弱。

但是從整體上看，Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收在所選的Na+濃度范圍內(nèi)，雖有一定的變化，但是變化不是很顯著。這說明，人體正常的Na+濃度范圍內(nèi)，Thr-Thr-Thr-DNA體系的處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.1.5 體系PO43-濃度對Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響（圖5）

圖5PO43-濃度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響Fig.5Effect of PO43-on the UV-Vis absorption spectra of Thr-Thr-Thr interaction with DNA

PO43-的加入，會使得Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收發(fā)生一定的波動。其中當(dāng)PO43-的濃度為0.8m mol·L-1時，體系的紫外吸收有一極小值（0.385）。然后，隨著PO43-濃度逐漸增加，體系的紫外吸收又緩慢的增加。從圖5可以看出，體系紫外吸收的波動是在一個較小的范圍內(nèi)進行的，即在所選PO43-濃度范圍內(nèi)，對Thr-Thr-Thr-DNA體系來說，外在環(huán)境的影響是相對較小的。

2.1.6 結(jié)合常數(shù)的計算設(shè)游離態(tài)與結(jié)合態(tài)DNA的總濃度分別為[L]與[L′]，DNA的分析濃度為CL（CL=[L]+[L′]），則溶液的吸光度可表示為[7]：

式中ε，ε′：分別表示游離與結(jié)合態(tài)DNA的平均摩爾吸光系數(shù)，εCL：DNA空白溶液的吸光度。令：

則由式（1）可得

△ε在測量條件和溶液酸度一定時為定值。

假定在溶液中反應(yīng)符合以下關(guān)系：

式中CP：氨基酸寡肽的分析濃度；K：表觀結(jié)合常數(shù)。

將式（4）及關(guān)系式[L]=CL-[L′]代入上式得：

上式兩端同時除以KCPCLΔA，移項，得

根據(jù)上式，若在實驗中固定CL，改變CP，則△A-1與CP-1呈線性關(guān)系，由回歸直線的截距與斜率可得Δε，K。在求得K之后，可根據(jù)n=KCL的關(guān)系計算最大結(jié)合數(shù)n。

表1 不同濃度的Thr-Thr-Thr對應(yīng)的DNA在260nm處吸光值變化Tab.1Values of ΔA at different concentration of Thr-Thr-Thr

表2 ΔA-1與Cp-1關(guān)系表Tab.2Relationships between ΔA-1and C-1p

圖6 ΔA-1與Cp-1關(guān)系的關(guān)系圖Fig.6Relationships between ΔA-1and Cp-1

線性回歸方程為：y=2.788×10-4x+179.1，R2= 0.8615，相關(guān)系數(shù)R=0.93。（ΔεCL）-1=179.1，（ΔεKCL）-1=2.788×10-4。根據(jù)式（6）可求出結(jié)合常數(shù)K=6.4×105L·mol-1，最大結(jié)合數(shù)n=7.04。

2.2 凝膠電泳法

為了檢驗Thr-Thr-Thr是否嚴(yán)重的破壞了DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳分析Thr-Thr-Thr與pUC18DNA的相互作用。若電泳后，出現(xiàn)不同遷移率的pUC18DNA，則說明Thr-Thr-Thr嚴(yán)重的破壞了DNA的結(jié)構(gòu)，使得DNA開環(huán)或出現(xiàn)缺口[8]。

圖7是含不同濃度Thr-Thr-Thr的DNA溶液的電泳圖。

圖7 含不同濃度Thr-Thr-Thr的DNA溶液的電泳圖Fig.7Electrophoretogram of different concentration of Thr-Thr-Thr interacted with DNA

從圖7可看出，加入不同濃度Thr-Thr-Thr（1至8泳道，Thr-Thr-Thr濃度不斷增加）的DNA的遷移率基本一致。不同濃度的Thr-Thr-Thr并沒有使得DNA斷裂。這說明了不同濃度Thr-Thr-Thr對DNA的結(jié)構(gòu)可能有破壞作用，但并不使DNA斷裂。這與紫外光譜法得到的結(jié)論是相符的。

3 結(jié)論

本文通過紫外光譜法和凝膠電泳法研究了蘇氨酸三肽與DNA的相互作用，考察了蘇氨酸三肽濃度、時間、Na+強度和PO34-濃度對二者相互作用的影響，通過實驗現(xiàn)象綜合分析得到蘇氨酸三肽是以溝槽的模式與DNA相互作用的。并計算得到了二者結(jié)合常數(shù)和最大結(jié)合數(shù)。

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Study on interaction of threonine-tripeptide and DNA*

WANG Gang1，MA Ying-jie2，LU Kui2
（1.Wuhan Bioengineering Instituge,Wuhan 430415,China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Zhengzhou 450052,China）

The interaction betweenThr-Thr-Thr and DNA was studied by UV-Vis spectrophotometry and gel electrophoresis method in the physiological environment of human’s.The results showed that there was an interaction between Thr-Thr-Thr and DNA.The action model might be groove combination.The Binding Constant（K=6.4×105L·mol-1）and the maximum binding number（n=7.04）were obtained.

UV-Vis spectrophotometry；gel electrophoresis method；threonine-tripeptide；DNA；interaction

book=2010,ebook=267

O657.3

A

1002-1124（2010）11-0007-05

2010-09-06

國家自然科學(xué)基金資助項目（NO.20572016，NO.20772023）；河南省教育廳科技計劃資助項目（NO.2006KYCX017）

王剛（1982-），男，武漢市人，實驗師，本科。