飼料中蛋氨酸HPLC檢測方法的建立

盧志勇，高學(xué)軍，黃建國，劉曉飛，李學(xué)琳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

蛋氨酸是飼料中含硫氨基酸，在動物營養(yǎng)上有極大的價值。蛋氨酸的測定方法多種多樣，主要有離子交換色譜法、氨基酸分析法、紫外分光光度法、高效液相色譜（HPLC）檢測法等。但飼料在水解的過程中蛋氨酸會被部分氧化，離子交換色譜法、氨基酸分析法、紫外分光光度法無法準確測出蛋氨酸含量，而常規(guī)HPLC檢測法在測定時只注重測定水解物中的蛋氨酸，也無法準確計算出蛋氨酸的含量[1]。本試驗通過HPLC對蛋氨酸及蛋氨酸氧化物（蛋氨酸砜）進行柱前衍生，測定飼料中的蛋氨酸含量，從而提高對蛋氨酸檢測的準確度，為今后飼料蛋氨酸的檢測提供了一種準確可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：SPD-10AV高效液相色譜儀（日本島津生產(chǎn)）；N3000色譜工作站（浙江大學(xué)提供）；微型漩渦混合儀（上海精科實業(yè)有限公司生產(chǎn)）；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）；純水儀（PALL公司生產(chǎn)）。

試劑：DL-蛋氨酸標(biāo)準品（色譜純，天津市光復(fù)精細化工研究所生產(chǎn)）；DL-蛋氨酸砜標(biāo)準品（Alfa Aesar，Stock#B25094），其他試劑均為國產(chǎn)分析純；Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.0）；30 mg·mL-1CDNB 溶液（2,4-二硝基氯苯溶液）[2]。

1.2 色譜條件

C18不銹鋼分離柱 YMC（5 μm 4.6×150 mm）；流動相：含φ＝30%乙腈的0.01 mol·L-1NaAC緩沖液（pH 5.2），取 0.01 mol·L-1pH 5.2 NaAC 緩沖液700 mL與色譜純乙腈300 mL混合，經(jīng)0.45 mm微孔濾膜真空抽濾，超聲脫氣；檢測波長350 nm；柱溫 25℃；流速 0.8 mL·min-1。衍生后的試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后直接上樣，體積10 μL，測定其中蛋氨酸含量。

1.3 樣品液的準備

稱取含蛋白質(zhì)10～20 mg的試樣（約50～100 mg，準確至 0.1 mg），按照 GB/T 18246-2000中酸水解法進行水解。水解后冷卻，混勻，用40%的NaOH調(diào)pH到7.0，過濾，用三蒸水反復(fù)沖洗離心管和濾器，定容至50 mL，吸取1 mL濾液，待用。

1.4 蛋氨酸、蛋氨酸砜和氨基酸水解液的衍生

配置含蛋氨酸 2、5、10、20、40、60、80 μg·mL-1的蛋氨酸標(biāo)準液各 1 mL[3]。分別置于 6個20 mL的離心管中，再分別加入pH 9.0 Na2CO3-NaHCO3緩沖液2 mL，混勻后，加入過量的CDNB（1：1.39），用微型漩渦混合儀混勻，置于 80℃ 恒溫水浴鍋中，避光暗反應(yīng) 1 h，取出，冷卻至室溫，用 0.05 mol·L-1鹽酸調(diào) pH至 7.0，用三蒸水稀釋至50 mL容量瓶中定容，混勻。蛋氨酸砜和氨基酸水解液處理步驟同上。

1.5 蛋氨酸含量計算

蛋氨酸的分子式為C5H11O2NS，蛋氨酸砜的分子式為C5H11NO4S，在試樣水解過程中，蛋氨酸會部分氧化成蛋氨酸砜，由化學(xué)性質(zhì)可以得出1 mol蛋氨酸氧化生產(chǎn)1 mol蛋氨酸砜，通過物質(zhì)量的比可準確算出蛋氨酸的總量，見式（1）。

其中，m1為蛋氨酸砜的質(zhì)量；m2為蛋氨酸的質(zhì)量。

1.6 飼料蛋氨酸含量的測定

按一定比例將豆粕和玉米蛋白粉進行復(fù)配，通過益生菌發(fā)酵獲得富含蛋氨酸飼料，稱取50 mg，按照GB/T 18246-2000中酸水解法進行水解。

2 試驗結(jié)果

2.1 蛋氨酸標(biāo)準樣品衍生后峰形的鑒別和標(biāo)準曲線的建立

蛋氨酸標(biāo)準品衍生液HPLC結(jié)果見圖1，標(biāo)準曲線見圖2。

由圖1可見，從左邊起第 1個峰為CDNB在堿性條件下形成的DNP-OH，第2個峰為經(jīng)CDNB衍生生成的DNP-蛋氨酸，為目的峰，出峰時間為9.788 min。以峰面積（μV.s）對進樣濃度（μg·mL－1）所得作直線回歸，獲得回歸方程Y=6169.9X-40468。在進樣量為2～80 μg·mL-1的范圍內(nèi)，經(jīng)重復(fù)進樣，線性系數(shù)均在0.9839，在此范圍內(nèi)進樣濃度峰面積呈良好的線性相關(guān)。

圖1 60 μg·mL－1的標(biāo)準品衍生液 HPLC 結(jié)果

圖2 蛋氨酸標(biāo)準曲線

2.2 蛋氨酸砜標(biāo)準樣品衍生后峰形的鑒別和標(biāo)準曲線的建立

蛋氨酸砜標(biāo)準品衍生液HPLC結(jié)果見圖3，標(biāo)準曲線見圖4。

圖3中從左邊起第 1個峰為 CDNB在堿性條件下形成的DNP-OH，第2個峰為經(jīng)CDNB衍生生成的DNP-蛋氨酸砜，為目的峰，出峰時間為8.463 min。獲得回歸方程 Y=2912.2X-10844，R2=0.9919。

2.3 飼料樣品衍生圖譜分析

飼料樣品衍生液HPLC結(jié)果見圖5。

由圖5可知，8.472 min為蛋氨酸砜的目的峰，9.797 min為蛋氨酸的目的峰。結(jié)果表明，蛋氨酸和蛋氨酸砜衍生后目的峰分離良好，把峰面積代入標(biāo)準曲線中，經(jīng)計算可以準確的得出飼料中蛋氨酸總量。本試驗選取飼料樣品檢測結(jié)果為每克飼料中含有蛋氨酸163.56 mg。

3 討論

本試驗對蛋氨酸和蛋氨酸氧化物（蛋氨酸砜）進行柱前衍生，并采用HPLC方法準確地測定了飼料氨基酸水解液中的蛋氨酸總量。目前有兩種新型衍生劑6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯（AOC）和 2,4-二硝基氯苯（CDNB）[4]。本試驗選取新型衍生劑CDNB，不但價格便宜，易購得，而且能與蛋氨酸和蛋氨酸氧化物生成性質(zhì)穩(wěn)定的二硝基氯苯蛋氨酸和二硝基氯苯蛋氨酸砜，而過量的CDNB對試驗無影響，線性關(guān)系良好。衍生后經(jīng)HPLC C18柱分離，UV 350 nm檢測，用含有φ＝30%乙腈的 0.01 mol·L-1NaAC 緩沖液（pH 5.2）為流動相，蛋氨酸和蛋氨酸砜與其他氨基酸分離良好。本試驗研究了飼料中蛋氨酸含量的測定方法，較好地解決了蛋氨酸在酸性水解過程中易氧化難以測定的問題，提高了蛋氨酸測定的準確度，為測定飼料中蛋氨酸含量提供了新的方法。

[1]常碧影,閻惠文,張明,等.飼料氨基酸的測定國標(biāo)研制[J].飼料工業(yè),2000,21（2）:1-4.

[2]趙劍虹.柱前紫外衍生——高效液相色譜法測定血清和飲料中18種游離氨基酸[D].成都:四川大學(xué),2006.

[3]黃建國,高學(xué)軍,佟慧麗,等.HPLC測定飼料源小肽產(chǎn)品中賴氨酸含量[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2009（2）:78-80.

[4]Callejón R M,Tesfaye W,Torija M J,et al.HPLC determination of amino acids with AQC derivatization in vinegars along submerged and surface acetiWcations and its relation to the microbiota[J].Eur Food Res Technol,2007,227:93-102.