棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育的觀察

林 彬，黃宗文，駱 劍，郭仁湘，楊 薇，陳國(guó)華

（海南大學(xué)海洋學(xué)院 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育的觀察

林 彬，黃宗文，駱 劍*，郭仁湘，楊 薇，陳國(guó)華

（海南大學(xué)海洋學(xué)院 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

在觀察了自然產(chǎn)卵的棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育過程的基礎(chǔ)上，依據(jù)各個(gè)發(fā)育階段的形態(tài)變化特征制訂了系統(tǒng)的分期標(biāo)準(zhǔn).棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育可劃分為受精卵、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官發(fā)生和孵化6個(gè)階段，共23個(gè)時(shí)期.比較同屬其他石斑魚的胚胎發(fā)育發(fā)現(xiàn)：不同種石斑魚胚胎發(fā)育速率的差別可能與物種成魚大小的差別存在一定的聯(lián)系；石斑魚卵子油球的狀況可能作為卵子質(zhì)量的參考.此外，養(yǎng)殖條件下棕點(diǎn)石斑魚自然產(chǎn)卵有較強(qiáng)的規(guī)律性，這對(duì)其人工繁育和育苗有非常好的幫助.

棕點(diǎn)石斑魚；自然產(chǎn)卵；胚胎發(fā)育

自1966年鵜川正雄［1］等人首次報(bào)道了赤點(diǎn)石斑魚的產(chǎn)卵行為以后，國(guó)內(nèi)外對(duì)各種石斑魚的人工繁殖和養(yǎng)殖研究工作相繼展開.我國(guó)自20世紀(jì)70年代開始研究石斑魚人工繁殖技術(shù)，已取得了青石斑魚（E.awoara）、赤點(diǎn)石斑魚（E.akaara）、斜帶石斑魚（E.coioides）、點(diǎn)帶石斑魚（E.malabaricus），鞍帶石斑魚（E.lanceolatus）等10余種石斑魚人工繁殖的成功［2］.其中關(guān)于石斑魚的胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育的研究工作為石斑魚人工繁育技術(shù)的發(fā)展提供了第一手的參考資料［3-8］，推動(dòng)了我國(guó)石斑魚產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展.

棕點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）俗稱老虎斑，隸屬鱸形目（Perciformes）鱸亞目（Percoidei）鮨科（Serranidae）石斑魚屬（Epinephalus）.由于其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，已成為南方4省石斑魚產(chǎn)業(yè)中的重要品種.目前棕點(diǎn)石斑魚的人工繁殖已經(jīng)取得了突破［9］，然而其受精率和孵化率非常不穩(wěn)定，導(dǎo)致苗種的供給無(wú)法適應(yīng)市場(chǎng)的需求變化.針對(duì)此問題，筆者系統(tǒng)觀察了棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育的過程，并依據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征制定了分期標(biāo)準(zhǔn).一方面可為解決人工繁育中孵化環(huán)節(jié)中存在的問題提供參考，另一方面棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育的資料在比較胚胎學(xué)上也具有一定的研究?jī)r(jià)值.

1 材料與方法

1.1 親魚來源

實(shí)驗(yàn)親魚為海南省青利水產(chǎn)有限公司在陵水新村港養(yǎng)殖漁排所蓄養(yǎng)的4～5齡棕點(diǎn)石斑魚，產(chǎn)卵前對(duì)網(wǎng)箱中的親魚進(jìn)行強(qiáng)化培育.在海南省陵水海域，棕點(diǎn)石斑魚親魚產(chǎn)卵季節(jié)為4～11月，產(chǎn)卵日期一般在每月的18～23日.

1.2 產(chǎn)卵地點(diǎn)和時(shí)間

產(chǎn)卵及胚胎發(fā)育觀察的地點(diǎn)為陵水縣新村港養(yǎng)殖漁排，2009年10月18～21日.

1.3 設(shè)備和工具

主要的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和工具為ALPHA PHOT-2 YS2顯微鏡、Nikon COOLPIX P5100數(shù)碼相機(jī)、充氣泵和普通撈卵工具等.

1.4 胚胎發(fā)育觀察記錄方法

棕點(diǎn)石斑魚產(chǎn)卵時(shí)間一般為22：00點(diǎn)至次日1：00，在此時(shí)間段每隔10 min用80目手抄網(wǎng)在產(chǎn)卵網(wǎng)箱中打撈檢查.發(fā)現(xiàn)受精卵后，立即記錄該時(shí)間為產(chǎn)卵時(shí)間并實(shí)時(shí)測(cè)量水溫及海水鹽度.在胚胎發(fā)育早期的受精卵至原腸期，每10 min在顯微鏡下觀察記錄1次，每次記錄10枚胚胎；胚體期至孵化期每30 min觀察記錄1次，每次記錄20～30枚胚胎.胚胎發(fā)育各時(shí)期時(shí)間點(diǎn)的確認(rèn)以鏡檢約50％的胚胎出現(xiàn)相應(yīng)分期特征為標(biāo)準(zhǔn)；各發(fā)育時(shí)期的劃分參考硬骨魚類的胚胎發(fā)育分期方法［10］.

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)卵時(shí)間

2009年10月19日，23：30打撈到受精卵，立即鏡檢發(fā)現(xiàn)個(gè)別受精卵開始第一次卵裂，大多數(shù)處于未分裂狀態(tài).

親魚產(chǎn)卵結(jié)束后，在產(chǎn)卵網(wǎng)箱中共收集到800 g受精卵，經(jīng)過靜置沉淀，上層浮卵為305 g，受精率為38.1％.

2.2 胚胎發(fā)育的特征和時(shí)間的劃分

棕點(diǎn)石斑魚受精卵在水溫26.5～28.0℃，鹽度30～32的海水中培育，歷經(jīng)22 h完成整個(gè)胚胎發(fā)育過程，進(jìn)入胚后發(fā)育.棕點(diǎn)石斑魚發(fā)育過程見表1.

2.2.1 受精卵

棕點(diǎn)石斑魚的受精卵為硬骨魚類端黃卵，圓形透明呈浮性，卵徑為0.820±0.015 mm，卵的中央有一直徑約0.235±0.010 mm的大油球（見圖版1-1）.受精后約20 min，由皮層的細(xì)胞質(zhì)發(fā)生向動(dòng)物極集中形成一個(gè)盤狀隆起，即為胚盤隆起.

2.2.2 卵裂期

棕點(diǎn)石斑魚的卵裂方式為盤狀卵裂.受精后26 min出現(xiàn)第1次卵裂，為經(jīng)裂，將胚盤分割成2個(gè)大小均等的細(xì)胞（見圖版1-2）；受精后約30 min進(jìn)行第2次分裂，分裂面與第一個(gè)卵裂面垂直，成十字狀把胚盤分裂成4個(gè)均等細(xì)胞，進(jìn)入4細(xì)胞期（見圖版1-3）；受精42 min后，完成第3次卵裂，形成8個(gè)細(xì)胞.此次卵裂有2個(gè)分裂面，都與第一次平行，結(jié)果形成2排，每排4個(gè)細(xì)胞的胚盤（見圖版1-4）；受精后55 min，完成第4次卵裂，此次卵裂也有2個(gè)分裂面，與第2次平行，結(jié)果形成4排，每排為4個(gè)分裂球的16細(xì)胞（見圖版1-5）；受精后1 h16 min，完成第5次卵裂，此次卵裂為緯裂，形成32個(gè)細(xì)胞（見圖版1-6）.從這次分裂起，分裂面切割細(xì)胞的速度開始出現(xiàn)差異，從肉眼觀察已較難分辨是垂直分裂還是平行分裂，受精后大約1 h30 min，完成第6次分裂，形成64個(gè)細(xì)胞（見圖版1-7）.卵裂球細(xì)胞的排列很不規(guī)則，且大小不一，細(xì)胞之間的界線也難以分辨.此后細(xì)胞開始出現(xiàn)層疊現(xiàn)象；受精后1 h55 min，可觀察到細(xì)胞成不規(guī)則方形，大小不均等，細(xì)胞明顯變小，此時(shí)無(wú)法對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)，胚胎進(jìn)入多細(xì)胞期（見圖版1-8）.隨著分裂進(jìn)行，細(xì)胞進(jìn)一步變小，受精后約2 h15 min，與桑椹球形狀非常相似，此時(shí)進(jìn)入桑椹胚期（見圖版1-9）.

2.2.3 囊胚期

受精后2 h50 min，細(xì)胞數(shù)目的不斷增加與堆積，胚盤與卵黃之間形成囊胚腔，囊胚中間明顯向上隆起成高帽狀，此時(shí)進(jìn)入高囊胚期（見圖版1-10）；受精后4 h15 min，由隆起的高帽狀逐漸變低，囊胚變的扁平，細(xì)胞進(jìn)一步變小變多，此時(shí)進(jìn)入低囊胚期（見圖版1-11）.

表1 棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育分期Tab 1 Different periods of embryonic development of Epinephelus fuscoguttatus

2.2.4 原腸期

在囊胚階段后期，囊胚邊緣的細(xì)胞增多，這些邊緣的細(xì)胞開始沿卵黃外圍向植物極方向遷移、延伸和下包，逐漸將卵黃囊包裹其中.囊胚細(xì)胞在赤道面附近某一位置發(fā)生內(nèi)卷，胚胎進(jìn)入原腸期.棕點(diǎn)石斑魚原腸胚期可分為原腸早期、原腸中期和原腸晚期3個(gè)發(fā)育階段.受精后4 h53 min，邊緣細(xì)胞增多增厚，緩慢運(yùn)動(dòng)并向內(nèi)卷，卵黃被胚層下包了約1/2，此時(shí)進(jìn)入原腸早期（見圖版1-12）.側(cè)面觀胚盾開始顯現(xiàn)；受精后5 h37 min，胚層下包卵黃囊3/4，進(jìn)入原腸中期（見圖版1-13），胚盾拉長(zhǎng)；受精后6 h32 min，進(jìn)入原腸晚期（見圖版1-14），胚層下包卵黃幾乎將卵黃囊全部包裹.

2.2.5 神經(jīng)胚期

原腸運(yùn)動(dòng)完成后胚胎背部增厚.受精后8 h20 min，胚層下包收縮成小圓孔，即胚孔.背部形成一條神經(jīng)索，標(biāo)志著進(jìn)入神經(jīng)胚期（見圖版1-15），胚體的輪廓初現(xiàn).

2.2.6 視泡形成期

從神經(jīng)胚晚期開始，胚胎的主要器官陸續(xù)出現(xiàn).在受精后9 h35 min，胚胎頭部明顯增大，頭部?jī)蓚?cè)出現(xiàn)1對(duì)視泡，出現(xiàn)2對(duì)肌節(jié)，此時(shí)為視泡形成期（見圖版1-16）.

2.2.7 聽囊形成期

受精后10 h36 min，器官繼續(xù)分化，聽囊形成（見圖版1-17），在頭部后方左右兩側(cè)出現(xiàn)1對(duì)聽囊，呈橢圓形.此時(shí)頭和尾已可以清楚分辨，胚胎擁有6對(duì)肌節(jié).

2.2.8 晶體形成期

在受精后13 h32 min，進(jìn)入晶體形成期（見圖版1-18），此時(shí)視泡內(nèi)的晶體輪廓清晰，胚體肌節(jié)8～10對(duì).本文未將腦泡的形成劃分為單獨(dú)一個(gè)時(shí)期，是因?yàn)榘凑占棺祫?dòng)物胚胎學(xué)的規(guī)律［9］，在視泡出現(xiàn)之時(shí)，腦泡的形態(tài)已存在，在聽囊、晶體形成之時(shí)膨大的腦泡是由于腦室的擴(kuò)大和分化造成的.

2.2.9 心臟形成期

受精后14 h30 min，胚體頭部的下方的胸腔逐漸膨大，心臟部位可見團(tuán)狀隆起，心臟開始形成.同時(shí)肌節(jié)增加到16～18對(duì)（見圖版1-19）.

2.2.10 肌肉效應(yīng)期

胚胎持續(xù)發(fā)育，頭部逐漸膨大，晶狀體、聽囊等更加清晰，可見離開卵面的尾芽，油球移到卵黃囊的后端.受精后大約18 h30 min，胚胎出現(xiàn)顫動(dòng)，此時(shí)為肌肉效應(yīng)期（見圖版1-20）.

2.2.11 心跳期

受精后20 h46 min，尾芽繼續(xù)延長(zhǎng)，聽囊內(nèi)可見一對(duì)耳石，心臟開始輕微跳動(dòng)，胚體顫動(dòng)頻率加快，此為心跳期（見圖版1-21）.

2.2.12 孵化期

隨著胚體的繼續(xù)發(fā)育，在受精后21 h15 min，心跳加快，胚體頭部破膜先孵出，然后尾部不斷擺動(dòng)，繼而完全脫去卵膜，此時(shí)期為出膜孵化期（見圖版1-22），再經(jīng)過大約50 min的發(fā)育時(shí)間，大部分仔魚孵出，剛孵出的仔魚全身透明，全長(zhǎng)約為1.81± 0.12 mm，帶有一個(gè)大的橢圓形卵黃囊（見圖版1-23）.

初孵的仔魚卵黃囊朝下，懸浮于水中，頭部?jī)蓚?cè)各有3支羽狀外鰓絲，尾部偶爾擺動(dòng)，無(wú)游泳能力.在水溫27±1℃，鹽度31±1的海水中，棕點(diǎn)石斑魚從受精卵到孵化出膜，整個(gè)胚胎發(fā)育過程歷時(shí)22 h.

3 討論

棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育經(jīng)歷卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官發(fā)生和孵化等6個(gè)階段，根據(jù)其形態(tài)變化特征可劃分為23個(gè)時(shí)期.其胚胎發(fā)育符合硬骨魚類胚胎發(fā)生的一般規(guī)律［10］，主要的差別在于棕點(diǎn)石斑魚的初孵仔魚頭部?jī)蓚?cè)各有3支羽狀外鰓絲，而其他有關(guān)石斑魚胚胎發(fā)育的報(bào)道很少見此特征的描述.其他方面與常見的石斑魚的胚胎發(fā)育過程［3-8］大體相似.

一般而言，同種魚類卵子在相同溫度條件下，卵子的大小對(duì)發(fā)育速率的影響不顯著.而就不同種魚類而言，所產(chǎn)的卵子越大其發(fā)育速率通常越慢［11］.棕點(diǎn)石斑魚受精卵的卵徑為0.820±0.015 mm，同屬的鞍帶石斑魚卵徑為0.85±0.02 mm［7］，斜帶石斑魚為0.78±0.16 mm［5］、點(diǎn)帶石斑魚為0.75～0.77 mm［6］，赤點(diǎn)石斑魚為0.7～0.8 mm［4］.這幾種石斑魚的卵子大小沒有明顯差別，然而其胚胎發(fā)育所需要的時(shí)間卻存在著差異.鞍帶石斑魚在水溫27±0.5℃的海水中，歷時(shí)約26 h完成胚胎發(fā)育［7］；點(diǎn)帶石斑魚在24.9～27.6℃的溫度下歷時(shí)21 h完成胚胎發(fā)育［6］；赤點(diǎn)石斑魚的這一數(shù)據(jù)是18 h（27.9～29.3℃）［4］，本研究中棕點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育歷時(shí)22 h（27±1℃）.對(duì)比這幾種石斑魚的胚胎發(fā)育時(shí)間數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，成魚體型最大的鞍帶石斑魚胚胎發(fā)育需要的時(shí)間最長(zhǎng)，而成魚體型相對(duì)較小赤點(diǎn)石斑魚胚胎發(fā)育時(shí)間最短，其他種類的差異不明顯，處于居中位置.這暗示著不同種的胚胎發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)短與物種成體的個(gè)體大小可能存在一定的聯(lián)系.

油球（或稱脂肪球）是石斑魚卵子通常擁有的構(gòu)造.關(guān)于油球的作用，以往認(rèn)為油球?qū)Ｋ~卵的浮性起主要作用，現(xiàn)已證實(shí)魚類卵子的浮性主要取決于卵黃內(nèi)水分的含量，而油球僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在的一種形式［11］.在各種石斑魚人工繁殖育苗工作中均有發(fā)現(xiàn)，油球的存在形式通常有一個(gè)或多個(gè).未成熟或卵質(zhì)不佳的卵子通常擁有10余個(gè)小油球［12］，這樣的卵子受精率孵化率非常低，幼苗畸形率高.此次棕點(diǎn)石斑魚胚胎實(shí)驗(yàn)采用的是自然產(chǎn)卵的卵子，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)多個(gè)油球的情況.在非人工授精的情況下，受精率達(dá)到了38％，畸形幼苗也非常稀少，這說明油球的狀況應(yīng)該可能作為判斷石斑魚卵子質(zhì)量的一個(gè)參考.

在人工養(yǎng)殖條件下，多數(shù)種類的石斑魚都很難自然產(chǎn)卵受精［13-14］.如鞍帶石斑魚在人工條件下自然產(chǎn)卵難以受精，催產(chǎn)的成功率也不高［7］.巨石斑魚、桔點(diǎn)石斑魚、云紋石斑魚、赤點(diǎn)石斑魚以及美洲黑石斑魚［13-15］等有過自行產(chǎn)卵的記錄，但產(chǎn)卵量和規(guī)律均難以預(yù)測(cè).點(diǎn)帶石斑魚在人工養(yǎng)殖條件下，通過強(qiáng)化培育能夠自然產(chǎn)卵，產(chǎn)卵量大卵子質(zhì)量較好［6］.棕點(diǎn)石斑魚在海南海灣漁排養(yǎng)殖條件下，每年4～11月，會(huì)在固定的日期自行產(chǎn)卵，規(guī)律性較強(qiáng)，這是其人工繁殖的優(yōu)勢(shì)條件.通過加強(qiáng)棕點(diǎn)石斑魚的親魚培育，提高其卵子的質(zhì)量和穩(wěn)定性，改進(jìn)孵化和育苗技術(shù)等，可望提高育苗的穩(wěn)定性，擴(kuò)大苗種規(guī)模，推進(jìn)棕點(diǎn)石斑魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.

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責(zé)任編輯：黃 瀾

Embryonic Development Observation of Epinephelus Fuscoguttatus

LIN Bin，HUANG Zongwen，LUO Jian*，GUO Renxiang，YANG Wei，CHEN Guohua
（College of Ocean，Hainan University；Key Laboratory of Tropic Biological Resources of Ministry of Education，Haikou 570228，China）

The embryos of Epinephelus fuscoguttatus collected by natural spawning are observed in detail.Based on the external morphological features，six periods including 23 stages of Epinephelus fuscoguttatus embryo are established，which are cleavage period，blastula period，gastrula period，neural period，organogenesis period and hatching period.The features of embryo development are consistent with those fishes of Epinephelus akaara，Epinephelus malabaricus and Epinephelus lanceolatus.The result indicates that the different of embryonic development rate in these groupers have some possible connections with its natural species size.For example，the embryonic development time of E.lanceolatus，a huge grouper，is longer than small groper E.akaara.The status of oil globule may be an evidence of eggs quality in groupers artificial propagation.Moreover，the self-acting spawning of E.fuscoguttatus，in culture condition，shows the preferable regularity.It's helpful to artificial propagation and larva.

Epinephelus fuscoguttatus；Natural spawning；Embryonic development

Q 132

A

1674-4942（2010）01-0087-06

2009-11-11

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD29B01）；海南大學(xué)重點(diǎn)科研項(xiàng)目（hd09xm11）

*通訊作者