血清結(jié)核抗體蛋白芯片檢測與痰抗酸染色實(shí)驗(yàn)室分析

朱同華

(江蘇省吳江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 吳江 215200)

由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病發(fā)病率近年來有所回升，嚴(yán)重危害人類的健康，已成為全球性重大的公共衛(wèi)生問題和社會問題，我國是全球22個(gè)高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病的患病人數(shù)在世界居第二位。因此結(jié)核病的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)對該病的預(yù)防和治療有極其重要的意義[1]。經(jīng)典的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法為痰Ziehl-Neelsen抗酸染色法，進(jìn)行顯微鏡下形態(tài)學(xué)檢查，但該方法存在操作繁瑣、靈敏度較低、受檢測者主觀因素影響及實(shí)驗(yàn)室交叉污染風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)，近年來國內(nèi)外相繼報(bào)導(dǎo)了脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、結(jié)核菌重組蛋白抗原16KD和38KD等在結(jié)核桿菌抗體檢測中的作用[2-3]，本實(shí)驗(yàn)采用南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司提供的蛋白芯片閱讀儀及結(jié)核分枝桿菌lgG抗體檢測試劑盒，探討蛋白芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌抗體的臨床應(yīng)用價(jià)值，并與痰抗酸染色法涂片鏡檢進(jìn)行方法學(xué)比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 肺結(jié)核患者均為2008年6月到2009年12月在我院住院接受治療的確診患者共計(jì)88例，正常人86例為體檢健康的某單位職工，均經(jīng)胸X拍片檢查，無結(jié)核病史。

1.2 標(biāo)本的采集與處理 標(biāo)本的采集與處理均按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版進(jìn)行操作，血清標(biāo)本為清晨空腹采集靜脈血，分離血清備用。痰液標(biāo)本采用自然咳痰法采集清晨溫開水漱口后的晨痰。

1.3 儀器與試劑 儀器為由南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的PBT-X2型生物識別儀、試劑為由南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌lgG抗體檢測試劑盒。痰抗酸染色試劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 結(jié)核抗體蛋白芯片檢測操作步驟及結(jié)果判斷：結(jié)核抗體蛋白芯片檢測操作步驟嚴(yán)格按南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌lgG抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后30min內(nèi)將蛋白檢測芯片放入PBT-X2型生物識別儀進(jìn)行結(jié)果分析，結(jié)果根據(jù)南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的芯片閱讀儀設(shè)置參數(shù)自動(dòng)判別后，直接打印結(jié)果報(bào)告。

該結(jié)核抗體蛋白芯片檢測試劑盒采用基因工程表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌16KD蛋白和結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)三種結(jié)核菌復(fù)合群特異性的抗原來檢測待檢血清中的抗體，如果三者之中任一抗體檢測結(jié)果為陽性，結(jié)果可判定為陽性。三種抗體檢測結(jié)果均為陰性，結(jié)果可判定為陰性。

2.2 痰涂片鏡檢 操作方法參見 《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[4]。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用χ2檢驗(yàn)

3 結(jié)果

血清結(jié)核抗體蛋白芯片檢測與痰抗酸染色的結(jié)果見表1。

表1 兩種檢測方法對174例各類標(biāo)本的檢測結(jié)果

結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片檢測靈敏度為83.0%，特異度96.5%，陽性預(yù)期值96.1%，陰性預(yù)期值84.7%。

4 討論

由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病，其發(fā)病率近年來有所回升，嚴(yán)重危害人體的健康，結(jié)核病的早期診斷對患者的治療及預(yù)后非常重要，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法很多，如經(jīng)典的痰Ziehl-Neelsen抗酸染色法、結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核菌分離培養(yǎng)及近年來發(fā)展起來的免疫學(xué)診斷方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)(DIGFA)、免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)(DICA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等，基因工程重組結(jié)核分枝桿菌16KD蛋白和結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖LAM三種抗原均為結(jié)核分枝桿菌特異性較高的抗原，存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，具有較強(qiáng)的免疫原性，適用于血清學(xué)診斷。一般的免疫學(xué)診斷方法大都采用上述抗原之一，南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司蛋白芯片技術(shù)同時(shí)采用上述三種抗原進(jìn)行檢測，提高了檢測的陽性率。蛋白芯片的原理是以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術(shù)將純化的結(jié)核分枝桿菌16KD蛋白和結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)三種抗原固定在同一膜片上，使抗原抗體反應(yīng)在微孔濾膜上快速進(jìn)行，以膠體金為標(biāo)記物在膜上直接顯色，通過芯片閱讀儀和特定的軟件進(jìn)行結(jié)果分析和判定，從而實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、多通量的檢測。

早期快速診斷對結(jié)核病鑒定是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，本研究對蛋白芯片檢測血清結(jié)核抗體與痰涂片鏡檢結(jié)核菌結(jié)果對比，由表1可以看出，臨床實(shí)驗(yàn)及方法學(xué)比較顯示，對結(jié)核病人的診斷中，蛋白芯片法檢測血清結(jié)核抗體與痰涂片鏡檢陽性率具有顯著性差異。χ2=39.56 P＜0.05，蛋白芯片法的敏感度為83.0%，特異性為96.5%，結(jié)核抗體三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高痰涂片陰性者的檢出率，同時(shí)具有簡便、快捷和受主觀因素影響較低的優(yōu)點(diǎn)。但該方法的局限性在于使用血清樣本的測定和對免疫力極度低下者可能無法檢出及其它分枝桿菌的交叉反應(yīng)等。在痰液檢查中，痰涂片、抗酸桿菌鏡檢是我國目前應(yīng)用最為廣泛的方法，它具有設(shè)備要求低，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，適合各級醫(yī)療單位應(yīng)用，但其敏感性低及操作者的個(gè)體差異對結(jié)果影響較大也是其比較大的缺點(diǎn)。故血清結(jié)核抗體蛋白芯片檢測是結(jié)核病輔助診斷的好方法，值得推廣。

[1]汪謀岳.中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病分學(xué)會2002年學(xué)術(shù)會議簡介[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003,26(2):115-116.

[2]吳玉平,趙月娟,王永明,等.血清抗脂阿拉伯甘露聚糖抗體對活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷價(jià)值[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2000,12(6):344-345.

[3]張小剛,莊玉輝,何秀云,等.重組結(jié)核分枝桿菌38KD和16KD蛋白用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的價(jià)值[J].中國防癆雜志,2001,23(5):281-283.

[4]中國防癆協(xié)會.結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國防癆雜志,1996,18(1):18-31.