增殖誘導(dǎo)配體在肺癌中的表達(dá)及臨床意義*

孫寶蘭,朱 俐,王惠民△

(江蘇省南通大學(xué):1.附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 226001;2.航海醫(yī)學(xué)研究所 226001)

幾十年來,人們在肺癌的防治方面進(jìn)行了大量的研究,但肺癌的發(fā)病率和病死率仍逐年上升。統(tǒng)計(jì)資料表明:近20年來我國男性肺癌病死率增加120.93%,女性增加90.41%;在沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)男性發(fā)病率已達(dá)首位,女性亦已居第2、3位。增殖誘導(dǎo)配體(a proliferation-inducing ligand,APRIL)屬于腫瘤壞死因子超家族,在多種腫瘤組織中高表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)[1]。本研究用免疫組化SP法檢測肺癌中的APRIL蛋白表達(dá)情況,并分析高表達(dá)的APRIL與肺癌臨床病理特征的關(guān)系,為研究APRIL在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 石蠟標(biāo)本取自南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2003年4月至2007年6月間的肺癌病例82例,其中男50例,女32例,年齡34～75歲,平均59.7歲。每例均重新復(fù)習(xí)閱片。組織病理分型:非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)72例,包括鱗癌 35例,腺癌 33例,大細(xì)胞肺癌 4例;小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)10例。病理分級:高中分化53例,低分化29例。TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期67例,Ⅲ～Ⅳ期15例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例。同時(shí)選取5例炎性假瘤和16例正常肺組織做對照。術(shù)前均未接受放療、化療和免疫治療,標(biāo)本用10%甲醛固定,常規(guī)脫水后石蠟包埋,病理診斷無異議。所有標(biāo)本組織學(xué)分類和診斷均按WHO診斷標(biāo)準(zhǔn),TNM分期根據(jù)UICC劃分。

1.2 試劑與方法 濃縮型兔抗人APRIL多克隆抗體(美國,芝加哥),使用濃度2μ g/mL。即用型SP法免疫組化檢測試劑盒(美國GBI公司),DAB顯色試劑盒(北京中山生物有限公司)。將入選的所有組織蠟塊每一個均連續(xù)切片2～3張、切片厚度5μ m,其中1張行HE染色,其余用SP免疫組化方法檢測。用已知陽性切片做陽性對照,用PBS代替一抗作陰性對照,檢測程序嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷 以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞膜上同時(shí)出現(xiàn)淡黃至棕黃色顆粒者記為APRIL陽性細(xì)胞,以陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比及著色強(qiáng)度綜合計(jì)分做半定量分析。采用Allred′s[2]評分法,將陽性細(xì)胞數(shù)分為 6個級別:0,無細(xì)胞染色;1,＜1%的細(xì)胞染色;2,1%～10%的細(xì)胞染色;3,11%～33%的細(xì)胞染色;4,34%～66%的細(xì)胞染色;5,＞67%的細(xì)胞染色。細(xì)胞染色強(qiáng)度分為 4個級別:0,陰性(無染色);1,弱陽性(淡黃色);2,陽性(黃色);3,強(qiáng)陽性(棕黃色)。隨機(jī)選擇有代表性的10個高倍鏡視野,每個視野記數(shù)100個腫瘤細(xì)胞,將兩項(xiàng)指標(biāo)的評分相加,根據(jù)總的分?jǐn)?shù)分為3個級別:0分為陰性,1～6分為陽性,7～8分為強(qiáng)陽性。所有切片染色結(jié)果均經(jīng)病理醫(yī)生雙盲法進(jìn)行判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件,采用Pearson χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同肺癌組織類型APRIL表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色可見APRIL陽性表達(dá)主要定位于NSCLC(鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌)患者癌細(xì)胞的陽性細(xì)胞胞質(zhì)/胞膜上(圖1A、B、C),SCLC、炎性假瘤和正常組織中少見或陰性表達(dá)(圖1D、E、F)。72例NSCLC中63例APRIL陽性表達(dá)(87.5%),10例SCLC中1例陽性表達(dá)(10%),5例炎性假瘤和16例正常組織中APRIL全為陰性表達(dá),不同肺組織中APRIL蛋白表達(dá)陽性率比較見表1。

圖1 免疫組化SP法檢測肺癌組織中APRIL蛋白表達(dá)(中倍放大)

2.2 NSCLC中APRIL表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果如表2所示,APRIL蛋白表達(dá)與性別、年齡、組織學(xué)分型無關(guān)(均P＞0.05),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.035)、腫瘤病理分級(P=0.000)和 TNM分期(P=0.000)明顯相關(guān)。

表1 不同肺組織中APRIL蛋白表達(dá)陽性率比較

表2 APRIL蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

APRIL是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor,TNF)的一員,1998年首先由 Hahne等[1]發(fā)現(xiàn)并克隆成功,在正常組織僅有少量表達(dá),而在腫瘤特別是消化道腫瘤中呈高表達(dá),可通過旁分泌或自分泌兩種方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究證實(shí),APRIL在體外可誘導(dǎo)激活NF-kB通路刺激腫瘤細(xì)胞的增殖[3-4],并且腫瘤細(xì)胞本身也能夠表APRIL[5-6],通過RFQ-PCR(fluorescent quantitative real time-PCR)方法對肝癌、胃癌的癌組織及遠(yuǎn)端正常組織APRIL mRNA的檢測發(fā)現(xiàn),其在癌組織的表達(dá)量明顯高于健康組織[7-8],這些結(jié)果提示APRIL與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān),并可作為腫瘤發(fā)生的檢測診斷指標(biāo)。

本研究采用免疫組化技術(shù)檢測APRIL蛋白在肺癌中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)APRIL主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和(或)胞漿中,APRIL在NSCLC表達(dá)陽性率明顯高于SCLC和正常組織(P＜0.05),而在SCLC中未見明顯異常,提示APRIL在肺癌尤其在NSCLC中高表達(dá),這一結(jié)果與施健等[8]從mRNA水平探討APRIL在肺癌組織中高表達(dá)基本一致。APRIL在NSCLC和SCLC中的表達(dá)差異,可能與不同癌細(xì)胞來源有關(guān),至于產(chǎn)生這種差異的分子機(jī)制,尚須深入研究。

在分析APRIL蛋白表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系中,發(fā)現(xiàn)APRIL表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級、TNM分期有關(guān),APRIL表達(dá)陽性率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05),低分化組顯著高于高中分化組(P＜0.01),Ⅲ、Ⅳ期患者中的表達(dá)強(qiáng)度和陽性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＜0.01),表明APRIL與肺癌組織惡性生長和臨床進(jìn)展之間存在著一定關(guān)系,隨著肺癌病變的加重,以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生,APRIL的陽性表達(dá)率增高,提示APRIL陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)有關(guān),表達(dá)APRIL的腫瘤細(xì)胞更具侵襲力。本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過運(yùn)用 RNA干擾技術(shù),發(fā)現(xiàn)APRIL基因參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Okano等[9]在研究APRIL在人肝細(xì)胞癌中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)APRIL不但能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,還能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SKHep1和HepG2中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)上調(diào),最終促進(jìn)肝癌的侵襲發(fā)展。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞可以大量分泌VEGF,VEGF在腫瘤間質(zhì)的形成和新生血管形成中起關(guān)鍵作用,并且與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。董桂芝等[11]用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測189例初診肺癌患者sVEGF水平,發(fā)現(xiàn) sVEGF亦與臨床分期密切相關(guān),Ⅲ、Ⅳ期患者sVEGF的水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者,也有研究者利用血清測定VEGF發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中 VEGF水平明顯升高[12]。這些結(jié)果都提示 APRIL在癌癥的發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用與VEGF的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。因此作者認(rèn)為,APRIL在肺癌中尤其在NSCLC中高表達(dá),而且與NSCLC發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系,為肺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究和預(yù)后提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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