高糖對腎小球系膜細胞Smurf2表達的影響*

馬紅艷,肖 斌,鐘?；?顧峻林,徐 玲,徐 勇△

(瀘州醫(yī)學院:1.附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科;2.生物化學教研室,四川 瀘州 646000;3.重慶市第七人民醫(yī)院 400054)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)又稱糖尿病腎小球硬化癥,是糖尿病特有而常見的微血管并發(fā)癥[1-2]。DN的發(fā)病機制仍未完全清楚,目前的基礎研究顯示泛素-蛋白酶體途徑(ubiquition-proteasome pathway,UPP)參與了腎臟纖維化多條信號通路中的重要信號蛋白分子(如轉化生長因子-β、絲裂原活化蛋白激酶、核因子-κ B)的降解調節(jié),引起信號通路的過度持久活化,促進腎臟纖維化。UPP是新近發(fā)現(xiàn)的一種依賴ATP胞漿內(nèi)非溶酶體高度選擇性蛋白質降解的主要途徑,參與調控細胞眾多重要的生理進程。發(fā)現(xiàn)蛋白質泛素降解原理的3位科學家因此獲得2004年諾貝爾化學獎。闡明UPP在各種疾病狀態(tài)下的病理生理作用,將為開發(fā)治療疾病的新的藥物靶點提供理論和實用依據(jù)。目前有關DN泛素蛋白酶體的研究尚甚少報道。

為此,本研究將UPP與高糖刺激的腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell,GMC)相聯(lián)系,對高糖刺激后大鼠GMC胞內(nèi)Smad泛素調節(jié)因子2(Smad ubiquitination regulatory factor 2,Smurf2)的mRNA和蛋白表達進行研究,旨在探討UPP在高糖誘導的GMC中是否活化,為闡明糖尿病腎小球硬化發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠HBZY-1系膜細胞株購自武漢大學保藏中心。Trizol購于美國MRC公司,Taq DNA聚合酶購于北京Bio Dev公司,dNTP購于美國 Promega公司,兔抗大鼠Smurf2多克隆抗體購于Santa Cruz公司,FITC標記的羊抗兔IgG熒光抗體購于北京中山公司,低糖DMEM培養(yǎng)基購于GIBCO公司,新生小牛血清購于成都哈里公司,胰蛋白酶購于Sigma公司,TritonX-100購于Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 腎小球系膜細胞用含10%小牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于試驗。將細胞分為4個組:(A)正常對照組,培養(yǎng)液含5.6mmol/L的葡萄糖;(B)20mmol/L高糖組;(C)30mmol/L高糖組,作為不同濃度的高糖刺激因子;(D)甘露醇組,5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇,作為滲透壓對照。

1.2.2 Real time Quantitative PCR測定Smurf2 mRNA 將按分組加入各處理因素后培養(yǎng)24h的細胞,Trizol提取總RNA,取總RNA5μ L為模板反轉錄成 cDNA。將反轉錄的 cDNA進行PCR擴增,管家基因β-actin做內(nèi)參。引物與TaqMan探針由TaKaRa公司合成。Smurf2:上游引物 5′-GGG AAC GCC CAA CAA GAC-3′,下 游引物 5′-ATT GCG GAT CTC CCA CCC-3′,擴增 產(chǎn)物大小為 136bp;β-actin 上游引 物 5′-GCC AAC ACA GTG CTG TCT-3′,下游引物 5′-AGG AGC AAT GAT CT T GAT CTT-3′,擴增產(chǎn)物大小為 114bp。將反轉錄成cDNA加入探針后行熒光定量 PCR。反應條件:94℃、2min,預變性;94℃20s,變性;60℃40s,擴增45個循環(huán)后收集數(shù)據(jù)繪制動力學曲線,讀取CT值。將各組目的基因的CT值與管家基因的CT值相減得△CT,再將各組的△CT與正常對照組的△CT相減得△△CT,計算出 2-△△CT即可得到各組模板的起始拷貝數(shù)之間的相對倍數(shù),擴增重復3次,從而計算出各組間mRNA的差別。

表1 各組大鼠腎系膜細胞Smurf2 mRNA表達比較

表1 各組大鼠腎系膜細胞Smurf2 mRNA表達比較

組別 n β-actin Smurf2 △CT 2-△△CT正常對照組 3 16.00±0.00 20.50±0.00 4.50±0.00 1.00±0.00 20mmol/L葡萄糖組 3 16.50±0.00 24.60±0.00 8.10±0.00 0.08±0.00 30mmol/L葡萄糖組 3 16.17±0.29 25.47±0.33 9.30±0.12 0.04±0.53甘露醇組 3 16.00±0.00 20.46±0.00 4.46±0.00 1.03±0.00

1.2.3 細胞免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡檢測Smurf2蛋白表達

1.2.3.1 細胞免疫熒光染色 將按分組加入各處理因素后培養(yǎng)了 24h的細胞爬片固定打孔后加入一抗:將兔抗大鼠Smurf2多克隆抗體200μ L滴加于細胞爬片,所有抗體工作濃度均為1∶50,濕盒37℃水浴作用60min,將濕盒放入4℃冰箱過夜(至少16h)。用PBS代替一抗作為陰性對照。加入二抗:將FITC標記的羊抗兔IgG熒光抗體200μ L滴加于細胞爬片,抗體工作濃度為1∶50,37℃水浴作用60min。

1.2.3.2 激光共聚焦顯微鏡成像及數(shù)據(jù)分析 使用德國Leica公司DM IRE2型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng),在數(shù)值孔徑1.32IMM的倒置甘油鏡下對細胞的熒光分布及強度進行觀察。測定時選用激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長520nm,掃描速度4 000Hz,檢測FITC標記的熒光染色陽性(綠色)的系膜細胞區(qū)域,整個檢測中測量參數(shù)維持不變。

采用德國Leica公司圖像分析系統(tǒng)對熒光強度進行定量分析,每張片子隨機選擇5個細胞的陽性信號,圖像分析系統(tǒng)自動測其熒光平均灰度值,實驗重復3次,再取其均值作為平均灰度值,以定量分析Smurf2蛋白在GMC中的表達水平。

2 結 果

2.1 real time quantitative PCR測定Smurf2 mRNA的表達與正常對照組比較,高糖各組Smurf2 mRNA表達均增強,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),30mmol/L高糖組表達強于20mmol/L高糖組。但甘露醇組與正常對照組比較,Smurf2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 1。

2.2 細胞免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡檢測系膜細胞Smurf2蛋白表達 各組鏡下免疫熒光圖像(圖 1)可見,Smurf2蛋白在正常對照組系膜細胞胞漿中有散在弱表達(圖1-A),高糖刺激后表達增強,呈星芒狀(圖1-B、圖1-C)。

圖1 各組系膜細胞Smurf2蛋白的表達(FITC標記的免疫熒光染色,×600)

熒光灰度值定量分析顯示,與正常組比較,高糖各組Smurf2蛋白表達均增強,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),30mmol/L高糖組表達強于20mmol/L高糖組。但甘露醇組與正常對照組比較,Smurf2表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),說明滲透壓對Smurf2表達無影響,見表2。

表2 各組系膜細胞Smurf2蛋白的平均灰度值比較

表2 各組系膜細胞Smurf2蛋白的平均灰度值比較

組別 平均灰度值正常對照組 25.93±3.35 20mmol/L高糖組 56.99±7.00 30mmol/L高糖組 96.36±9.19甘露醇組 26.53±3.45

3 討 論

生物體內(nèi)存在著兩類蛋白質降解過程,一種為溶酶體途徑,對于蛋白降解無選擇性,不需要能量;另一種為UPP,對胞內(nèi)蛋白發(fā)生能量依賴性、高度選擇性的特異性降解。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)廣泛存在于真核生物中,它由泛素、泛素連接酶、26S蛋白酶體和泛素再循環(huán)酶組成。E1(泛素激活酶)、E2(泛素結合酶)、E3(泛素-蛋白連接酶)統(tǒng)稱為泛素連接酶。其中在UPP中行使調控降解功能的核心成員E3對靶蛋白的識別和降解起關鍵作用。Smurf2是具有HECT結構域的E3,是本實驗研究的主要內(nèi)容。UPP參與細胞生長、分化與凋亡、信號轉導、轉錄調控、免疫應答及抗原呈遞等多種生命活動過程,尤其是通過降解細胞內(nèi)各信號通路的抑制因子或(和)激活因子發(fā)揮著上調或下調作用[3]。該途徑成分的改變可致蛋白質降解發(fā)生異常,細胞功能受到破壞,發(fā)生疾病。針對泛素蛋白酶體進行干預是疾病治療的新手段,前景喜人。

有關糖尿病并發(fā)癥時泛素蛋白酶體的研究尚少。國內(nèi)王曉等[4]發(fā)現(xiàn)高糖可使培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞泛素表達增加,其參與了凋亡的發(fā)生。Mastrocola等[5]和Cai等[6]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病肌肉萎縮是肌肉蛋白泛素降解增加的結果,糖尿病時心肌蛋白的泛素降解亦增加。Adachi Uehara等[7]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠和2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者泛素蛋白酶體途經(jīng)中泛素表達增加,提示糖尿病視網(wǎng)膜病變時存在蛋白轉錄后的調節(jié)異常與其發(fā)病相關。綜上所述,UPP在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起了重要作用,因此深入研究泛素蛋白酶體與糖尿病并發(fā)癥之間的相互關系,有助于了解糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制。

在腎臟方面,UPP是調節(jié)腎臟纖維化 TGF-β/smad信號通路的重要機制之一,其中Smurf2能特異地降解Smads和Smad通路某些調節(jié)蛋白[8],活化 TGF-β/smad通路。kavsak等[9]在與糖尿病腎臟纖維化發(fā)病有關的UUO小鼠模型中證實,腎臟纖維化時Smad7減少是由于Smurf2泛素化降解增加所致,提示泛素化降解Smad7增加是導致腎小管間質纖維化的重要原因。對Smurf2表達的調控可能成為阻斷腎臟TGF-β效應的具有生理學基礎的誘人策略。而DN時,TGF-β/smad通路作為多種致病因素的交匯點,同樣導致了腎臟纖維化,UPP是否亦在DN的病理進程中也發(fā)揮了重要作用?

本研究結果顯示在正常GMC內(nèi)只有少量的Smurf2 mRNA和蛋白表達,高糖可誘導GMC中泛素連接酶Smurf2的mRNA和蛋白增多,且具有濃度依賴性,提示高糖致泛素化降解增加,表明UPP參與DN的發(fā)病機制。高糖時Smurf2的高表達與滲透壓不相關,表明高糖不是通過滲透壓途徑,而是通過其他途徑影響Smurf2的表達。

DN時TGF-β/Smad通路的活化已得到公認。由于泛素存在的廣泛性,泛素對于細胞內(nèi)蛋白質降解的重要性,以及Smurf2對于Smad降解的特異性,結合本研究結果,作者推測:糖尿病時高糖激活腎臟Smurf2,致 TGF-β/Smad信號通路的活化。這是腎臟內(nèi)細胞因子TGF-β增多引起DN腎纖維化進展的機制之一。

[1] 黃曉燕,陳積雄,姚輝,等.2型糖尿病大鼠腎組織nephrin蛋白的表達及影響[J].重慶醫(yī)學,2009,38(3):305.

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[3] Murata T,Shimotohno K.Ubiquitination and proteasomedependent degradation of human eukaryotic translation initiation factor 4E[J].J Biol Chem,2006,281(29):20788.

[4] 王曉,李果,李紀平.泛素在高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡中的表達[J].上海第二醫(yī)科大學學報,2005,25(1):36.

[5] Mastrocola R,Reffo P,Penna F,et al.Muscle wasting in diabetic and in tumor-bearing rats:role of oxidative stress[J].Free Radic Biol Med,2008,44(4):584.

[6] Cai D,Frantz JD,Tawa NE Jr,et al.IKKbeta/NF-kappaB activation causes severe muscle wasting in mice[J].Cell,2004,119(2):285.

[7] Adachi Uehara N,Kato M,Nimura Y,et al.Up-regulation of genes for oxidative phosphorylation and protein turnover in diabetic mouse retina[J].Exp Eye Res,2006,83(4):849.

[8] Lin X,Liang M,Feng X.Smurf2 is an ubiquitin E3 ligase mediating proteasome-dependent degradation of Smad2 in transforming growth factor-beta signaling[J].J Biol Chem,2000,275(47):36818.

[9] Kavsak P,Rasmussen RK,Causing CG,et al.Smad7 binds to Smurf2 to form an E3 ubiquitin ligase that targets the TGF-β receptor for degradation[J].Mol Cell,2000,6(6):1365.