新清寧片微生物限度檢查方法研究

李 霞，董衛(wèi)紅，韓曼雪，關(guān) 鍵

(中國中醫(yī)科學(xué)院實驗藥廠，北京 100700)

新清寧片微生物限度檢查方法研究

李 霞，董衛(wèi)紅，韓曼雪，關(guān) 鍵

(中國中醫(yī)科學(xué)院實驗藥廠，北京 100700)

微生物限度檢查法;驗證;新清寧片

新清寧片是由熟大黃粉組成。熟大黃粉具有抑菌作用，按照《中國藥典》2005年版［1］1部附錄微生物限度檢查方法常規(guī)法檢查，部分細菌的回收率小于70%，達不到規(guī)定的要求。本文細菌檢查法采用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌、酵母菌、控制菌檢查法均采用常規(guī)法。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)，均按照《中國藥典》2005年版1部附錄要求配制。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］均符合《中國藥典》2005年版1部附錄要求。

1.3 供試品

新清寧片，批號090202。

2 方法

2.1 菌液的制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每ml含菌數(shù)為50cfu～100cfu的菌液備用;取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，23℃ ～28℃培養(yǎng)24h～48h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至菌液濃度為每1ml含菌數(shù)為50cfu～100cfu。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23℃ ～28℃培養(yǎng)5d～7d，加0.9%無菌氯化鈉溶液3ml～5ml洗下霉菌孢子，吸出孢子液，取1ml孢子液至0.9%無菌氯化鈉溶液9ml中，使菌液濃度為50cfu/ml～100cfu/ml。

2.2 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.2.1 供試品溶液的制備 取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1ml置pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液9ml中，即為1∶100的供試液。

2.2.2 微生物限度回收率測定 菌液組:分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、黑曲霉、白色念珠菌的菌液 1ml(含50～100cfu)，采用平皿計數(shù)法，含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的實驗平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃ ～35℃培養(yǎng)48h，計數(shù);白色念珠菌、黑曲霉的實驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23℃～28℃培養(yǎng)72h，計數(shù)。測定菌液中每毫升的活菌數(shù)。樣品對照組:取1∶100供試液1ml，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃ ～35℃培養(yǎng)48h，測定供試品本底的細菌數(shù);取1∶10供試液1ml，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23℃ ～28℃培養(yǎng)72h，測定供試品本底的霉菌和酵母菌數(shù)。實驗組:取1∶100的供試液1ml和上述細菌菌液1ml(含50cfu～100cfu實驗菌)，分別注入同一平皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃～35℃培養(yǎng)48h，進行細菌計數(shù)和回收率計算。取1∶10的供試液1ml和上述真菌菌液1ml(含50cfu～100cfu實驗菌)，分別注入同一平皿中，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23℃ ～28℃培養(yǎng)72h，進行霉菌和酵母菌計數(shù)和回收率計算?；厥章?%)=(實驗組細菌數(shù)－樣品本底菌數(shù))/驗證加菌數(shù)。實驗結(jié)果如下。

表1 微生物限度回收率測定

2.3 控制菌檢查方法的驗證

2.3.1 大腸埃希菌 接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每 ml含菌數(shù)為10cfu～100cfu的菌液備用。

供試液的制備:取本品10 ml，加pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試液分散均勻，制成1∶10的供試液，取1ml置pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9 ml中制成1∶100的供試液，以此類推，至1∶1000的供試液。

驗證方法:供試品組:取1∶10的供試液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，置35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h?？瞻讓φ战M:取稀釋液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基 100ml中，置 35℃ ～37℃ 培養(yǎng) 18h～24h。陰性菌對照組:取 1∶10的供試液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，加入金黃色葡萄菌10cfu～100cfu，置35℃ ～37℃培養(yǎng) 18h～24h。陽性對照菌組:取1∶10的供試液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，加入大腸埃希菌10cfu～100cfu，置35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h。取上述培養(yǎng)物0.2ml，分別加入含5ml的4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)試管中，置35℃ ～37℃培養(yǎng)5h～24h并觀察結(jié)果。

表2 控制菌檢查結(jié)果

結(jié)果顯示，陽性菌生長良好，表明供試品在該實驗條件下對大腸埃希菌沒有抑菌作用或是其抑菌作用可以忽略不計。陰性菌均未檢出，表明該方法的專屬性好，說明采用上述方法進行本品的大腸埃希菌檢查可行。

2.3.2 大腸菌群 供試品組:取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1∶10的供試液1ml、1∶100 供試液 1ml、1∶1000 供試液 1ml，作為供試品組。驗證方法:空白對照組:取與供試液等量的稀釋劑加入10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管中作為空白對照組。陰性菌對照組:取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入上述1∶10的供試液1ml、1∶100 供試液 1ml、1∶1000 供試液 1ml，分別加入金黃色葡萄球菌10cfu～100cfu作為陰性對照組。取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入上述 1∶10 的供試液 1ml、1∶100 供試液 1ml、1∶1000供試液1ml，分別加入大腸埃希菌10cfu～100cfu作為陽性對照組。將上述培養(yǎng)基管置35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h，結(jié)果如下。

表3 各對照組配置比例配比

結(jié)果顯示，陽性菌生長良好，表明供試品在該實驗條件下對大腸菌群的代表菌大腸埃希菌無抑菌作用或是其抑菌作用可以忽略不計;陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專屬性好，說明采用此方法進行本品的大腸菌群檢查可行。

3 結(jié)論

我們按照《中國藥典》2005年版1部微生物限度檢查法中常規(guī)法檢驗。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、黑曲霉、白色念珠菌實驗菌的回收率均大于70%。按照《中國藥典》2005年版1部微生物限度檢查法進行控制菌的方法學(xué)驗證試驗及檢查?？刂凭鷻z查陽性菌生長良好，說明本品對大腸埃希菌、大腸菌群沒有抑菌作用。陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查。

［1］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2005年版［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社.

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0825-02

2010-01-10