補(bǔ)陽還五湯家兔含藥血清對家兔血小板PAF受體活性的影響

張繼平，宮 麗，李齊歡，姚 暉，文鳳妮，李蜀光，林愛華，王志彬

(佛山市第二人民醫(yī)院，廣東佛山 528000)

補(bǔ)陽還五湯出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由生黃芪 120g，歸尾 6g，赤芍 4.5g，川芎、桃仁、紅花、地龍各3g組成，該方以其補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功一直用于臨床，療效顯著，是目前治療中風(fēng)等血栓性疾病的經(jīng)典名方。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯多次體內(nèi)給藥有提高家兔血小板活化因子(Platelet-activating Factor，PAF)受體與［3H］-PAF 放射配基特異結(jié)合量和特異結(jié)合率的趨勢，其作用與PAF特異性受體阻滯劑銀杏葉提取物無顯著差異;補(bǔ)陽還五湯注射液體外給藥有抑制家兔洗滌血小板PAF受體與放射配基的特異結(jié)合的作用。1988年日本學(xué)者田代真一正式提出“中藥血清藥理學(xué)”概念，中藥血清藥理學(xué)方法可在某種程度上克服中藥本身的理化因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，在中藥復(fù)方的藥理研究中具有極強(qiáng)的針對性。目前，已見神經(jīng)細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)方面的補(bǔ)陽還五湯血清藥理學(xué)研究報(bào)道，但該方在抑制血栓的作用機(jī)理方面的血清藥理學(xué)研究尚未見報(bào)道。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合血清藥理學(xué)和放射配基受體結(jié)合法，研究補(bǔ)陽還五湯家兔含藥血清對家兔血小板PAF受體活性的影響，以進(jìn)一步闡明該方防治血栓性疾病的藥理作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

新西蘭白色家兔，體重2.0kg～3.0kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào)粵監(jiān)證字2006A006 SYXK(粵)2003-0001，動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)SYXK(粵)2003-0001］。

1.2 藥物

飲片于佛山市康普醫(yī)藥公司和健民醫(yī)藥公司購得，按文獻(xiàn)方法制備補(bǔ)陽還五湯水煎液(含生藥量分別為1.16g生藥/ml、2.9g生藥/ml)和不含黃芪的補(bǔ)陽還五湯水煎液(組方為赤芍4.5g，歸尾6g，川芎、桃仁、紅花和地龍均為3g，含生藥量為2.9g生藥/ml)。將金納多片(批號(hào)8281005)研成細(xì)末，用蒸餾水配制成4.84mg/ml(按照家兔體表面積換算的臨床等效劑量的5倍)水溶液。

1.3 試劑

放射性同位素:［3H］-PAF(Amersham 公司，包裝量 250Ci，比活值 175Ci/mmol，批號(hào) 200402)，PAF標(biāo)準(zhǔn)品 5mg(L-105，PAF-18，Biomol公司，批號(hào)P1318V)，小牛血清白蛋白(BSA，MBChem分裝，批號(hào)20041108)，三羥甲基甲烷(Tris，進(jìn)口分裝，批號(hào)20030518)，2.5-苯基惡唑(PPO)及二甲基-POPO(Fluka Chemie瑞士，批號(hào)290981889)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器

LS-5810 型液閃儀(Beckman，美國)，ZT-Ⅱ型多頭細(xì)胞分離器(浙江紹興衛(wèi)星機(jī)械公司)，KDC-2046低速冷凍離心機(jī)(安徽科大創(chuàng)新股份公司中佳分公司)，WMZK-08型電熱恒溫干燥箱(廣州東方紅醫(yī)療器械廠)，YKH-Ⅱ型液體快速振蕩器(廣東汕頭廣播儀器廠)，微量加樣器、超低溫生物冰箱(日本SANYO公司)，其他冰箱(國產(chǎn))、水浴箱、一次性注射器、試管等。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

2.1.1 動(dòng)物分組 新西蘭家兔30只，雌雄各半，根據(jù)體重用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為補(bǔ)陽還五湯水煎液低劑量組(A組)、補(bǔ)陽還五湯水煎液高劑量組(B組)、不含黃芪的補(bǔ)陽還五湯水煎液組(C組)、金納多組(D組)、蒸餾水組(E組)5組。

2.1.2 含藥血清的制備 A組:用1.16g生藥/ml補(bǔ)陽還五湯水煎液10ml/kg灌胃;B組:用2.90g生藥/ml補(bǔ)陽還五湯水煎液10ml/kg灌胃;C組:用2.90g生藥/ml不含黃芪的補(bǔ)陽還五湯水煎液10ml/kg灌胃;D組:用4.84mg/ml金納多水溶液10ml/kg灌胃;E組:用等體積蒸餾水10ml/kg灌胃。每天1次，連續(xù)灌服5d，每組灌胃的藥物體積相同。有文獻(xiàn)報(bào)道，在96個(gè)藥物口服后達(dá)峰時(shí)間中，藥物口服給藥后1h～2h內(nèi)達(dá)峰的占藥物總數(shù)的91.66%，故在末次給藥前禁食12h，給藥結(jié)束2h后家兔清醒狀態(tài)下取耳中央動(dòng)脈血10ml，室溫靜置2h后離心(4℃ 2500r/min 10min)分離后的家兔血清于56℃水浴中30min滅活，分裝，－40℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ［3H］-PAF與洗滌血小板PAF受體結(jié)合測定

2.2.1 家兔洗滌血小板懸液的制備 正常家兔清醒狀態(tài)下頸總動(dòng)脈插管取血40ml，用3.8%枸櫞酸三鈉抗凝(血:抗凝劑，9∶1)混勻后塑料試管分裝，在4℃ 1000r/min(離心力200×g)離心10min，取上層富含血小板血漿加等體積的磷酸緩沖液(KH2PO40.22g，Na2HPO40.86g，檸檬酸 0.86g，葡萄糖0.44g，溶于500ml蒸餾水中，pH 6.5)混勻，在4℃ 2900r/min(離心力1682g)離心10min，取沉淀用等體積的磷酸緩沖液混勻，4℃ 3000r/min(離心力1800g)離心5min后棄上清，取血小板沉淀，重復(fù)洗滌1次;取沉淀的血小板加入含有0.1%BSA和1mmol/L的MgCl2磷酸緩沖液中，稀釋成(2.5～6)×107/ml的血小板懸浮液(PRP)備用。

2.2.2 放射配基受體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 總結(jié)合管(T):取 PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L，濃度為終濃度，下同)+蒸餾水5μl;非特異結(jié)合管(P):取 PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L)+冷PAF 5μl(1μmol/L);樣品管(Y):取PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L)+含藥血清 5μl;以上每管平行作三管，取均值計(jì)算之。加樣完畢后，在振蕩器上混合振搖30s，然后在25℃溫浴40min，用含有0.1%BSA的冰冷Tris緩沖液終止反應(yīng)，用多頭細(xì)胞分離器真空抽濾，過濾分離游離與結(jié)合的［3H］-PAF，濾紙用冰冷的Tris緩沖液洗4次，濾紙片放入紅外線烘箱內(nèi)(80℃，1h)烘干，置2ml已測本底的二甲苯閃爍液中，在液閃儀中測定放射性。計(jì)算特異結(jié)合率=［(T－P)/T］×100%和特異結(jié)合抑制率=［(T－Y)/(T－P)］×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽還五湯家兔含藥血清對［3H］-PAF與家兔血小板PAF受體結(jié)合的影響

表1顯示，補(bǔ)陽還五湯含藥血清能明顯抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體的特異結(jié)合，其抑制作用明顯強(qiáng)于蒸餾水組(P﹤0.01)，弱于金納多組(P﹤0.01);補(bǔ)陽還五湯高、低劑量組和不含黃芪的補(bǔ)陽還五湯組對［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結(jié)合的抑制率作用依次為不含黃芪的補(bǔ)陽還五湯組>補(bǔ)陽還五湯低劑量組>補(bǔ)陽還五湯高劑量組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無顯著性差異(P>0.05)。

表1 補(bǔ)陽還五湯含藥血清對［3H］-PAF與家兔血小板PAF受體結(jié)合的影響(±s)

表1 補(bǔ)陽還五湯含藥血清對［3H］-PAF與家兔血小板PAF受體結(jié)合的影響(±s)

注:同蒸餾水組比較:**P<0.01;同金納多組比較:△△P<0.01

組別 n 特異結(jié)合率(%)特異結(jié)合抑制率(%)補(bǔ) 陽 還 五 湯 低 劑 量 組 6 27.70±3.00**△△ 57.5± 6.23**△△補(bǔ) 陽 還 五 湯 高 劑 量 組 6 34.5 ±5.74**△△ 47.5 ±14.06**△△不 含 黃 芪 補(bǔ) 陽 還 五 湯 組 6 23.5 ±6.77**△△ 63.9 ±11.92**△△金 納 多 組 6 13.4±4.94** 84.2±12.33**蒸 餾 水 組 6 40.5±5.94△△ 27.9±10.27△△

4 討論

PAF來源相當(dāng)廣泛，體內(nèi)血小板、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞受到刺激后均能產(chǎn)生并釋放PAF。PAF具有廣泛的生物學(xué)作用，如強(qiáng)烈激活血小板作用、促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集、增加血管通透性等。PAF的多種生物學(xué)效應(yīng)要通過與其受體的特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。PAF受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，用3H-PAF或PAF拮抗劑3H-WEB2086進(jìn)行配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，證明在人和動(dòng)物許多組織和細(xì)胞表面都存在有PAF受體，其中血小板是PAF受體含量最多的組織之一。PAF是迄今發(fā)現(xiàn)體內(nèi)作用最強(qiáng)的血小板聚集劑，其特有的磷脂結(jié)構(gòu)與血小板膜受體結(jié)構(gòu)結(jié)合后，通過激活膜磷脂代謝及激發(fā)鈣離子進(jìn)入血小板使血小板聚集。PAF誘導(dǎo)的血小板聚集過程，不依賴于二磷酸腺苷(ADP)或花生四烯酸(AA)的代謝產(chǎn)物血栓素A2(TXA2)，故不被ADP清除和氧化酶抑制劑所阻斷，因而被認(rèn)為是誘導(dǎo)血小板聚集的第3條途徑。

許多嚴(yán)重危害人類健康疾病的發(fā)生發(fā)展與血栓形成密切相關(guān)。血管內(nèi)皮損傷、血小板功能亢進(jìn)、血液凝固性增高、纖溶活性降低、血液黏滯性增大、血流動(dòng)力與流態(tài)條件變差等都是血栓形成的重要原因。血小板參與了血栓形成的整個(gè)過程，血小板的激活是血栓形成過程中很重要的始動(dòng)因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激(如凝血酶、緩激肽和組胺等)可合成和釋放PAF，PAF一方面通過激活血小板促進(jìn)凝血酶和纖維蛋白生成，另一方面通過激活中性粒細(xì)胞造成血管內(nèi)皮受損。PAF與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等相互作用，在血栓形成過程中起著重要作用。近年臨床研究表明，中風(fēng)患者服用抑制TXA2生成的藥物，可以改善缺血性腦血管病的癥狀，該藥物通過抑制血小板環(huán)氧化酶代謝而阻止血栓形成，但不能阻斷由于PAF引起的血小板的繼續(xù)活化，此乃中風(fēng)難治的重要原因之一?；谶@一原因，在中風(fēng)治療時(shí)除考慮抑制TXA2、凝血酶、膠原等誘導(dǎo)血小板聚集的途徑外，抑制PAF誘導(dǎo)的血小板聚集對防止病理性血栓形成尤為重要。

補(bǔ)陽還五湯臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著，是目前中風(fēng)等血栓性疾病治療應(yīng)用頻率最高的方劑。中藥血清藥理學(xué)方法可在某種程度上克服中藥本身的理化因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，在中藥復(fù)方的藥理研究中具有極強(qiáng)的針對性。我們前期研究表明，補(bǔ)陽還五湯注射液體外給藥能明顯抑制家兔洗滌血小板PAF受體與放射配基的特異性結(jié)合，其特異結(jié)合抑制率與銀杏苦內(nèi)脂B相似，但高濃度反而抑制作用減弱;補(bǔ)陽還五湯體內(nèi)多次灌服給藥，能提高家兔洗滌血小板PAF受體與放射配基的特異結(jié)合量，其作用與銀杏葉提取物相似并高于空白組。本文研究發(fā)現(xiàn)，含補(bǔ)陽還五湯藥物血清能明顯增強(qiáng)抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體的特異結(jié)合，提示補(bǔ)陽還五湯含藥血清中某些活性成分有直接抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結(jié)合的作用。同時(shí)，結(jié)合補(bǔ)陽還五湯注射液對PAF受體與放射配基的特異結(jié)合有雙向調(diào)節(jié)作用，以及從不含黃芪的補(bǔ)陽還五湯注射液對［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結(jié)合的抑制作用明顯強(qiáng)于補(bǔ)陽還五湯注射液來分析，補(bǔ)陽還五湯組方中的黃芪對該方抑制家兔血小板PAF受體活性作用有緩和作用，體現(xiàn)了補(bǔ)陽還五湯中配伍大劑量生黃芪以求“大補(bǔ)元?dú)猓瑲馔源傺校铕龆粋钡呐湮闄C(jī)制，這與本課題組前期對補(bǔ)陽還五湯拆方研究發(fā)現(xiàn)生黃芪在補(bǔ)陽還五湯中可降低活血藥對PAF受體結(jié)合作用的過強(qiáng)抑制，使整方抑制［3H］-PAF與兔血小板受體結(jié)合的作用緩和結(jié)果一致。而補(bǔ)陽還五湯含藥血清對［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結(jié)合的抑制作用弱于金納多藥物血清，這與金納多是銀杏葉提取物，其中的萜類成分為血小板PAF受體的特異拮抗作用有關(guān)。

補(bǔ)陽還五湯含藥血清可以明顯抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體的特異結(jié)合而達(dá)到抑制血栓形成的目的，但究竟含藥血清中哪種活性成分起關(guān)鍵作用，或是多種活性成分間的協(xié)同作用，尚待進(jìn)一步研究。