血紅蛋白H病的高效液相色譜與血液學(xué)特點(diǎn)分析

張 力,區(qū)小冰,顏慕霞

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童院區(qū)血液室,廣東廣州 510120)

血紅蛋白H病的高效液相色譜與血液學(xué)特點(diǎn)分析

張 力*,區(qū)小冰,顏慕霞

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童院區(qū)血液室,廣東廣州 510120)

目的分析血紅蛋白H病(HbH病)在高效液相色譜及臨床血液學(xué)表現(xiàn)的特點(diǎn)并探討其原因。方法運(yùn)用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)對(duì)廣東地區(qū)49例缺失型或血紅蛋白Constant Spring(HbCS)復(fù)合HbH病進(jìn)行診斷,詳細(xì)記錄其臨床資料并測(cè)定其相關(guān)的血液學(xué)指標(biāo)。結(jié)果①缺失型HbH病患兒可見(jiàn)一HbH峰,HbCS復(fù)合HbH病患兒既可見(jiàn)-HbH峰,又可見(jiàn)-HbCS峰。49例HbH病患兒中,缺失型HbH病38例(77.7%),HbCS復(fù)合HbH病11例(22.3%);②與缺失型HbH病患兒相比,HbCS復(fù)合HbH病患兒有明顯的脾腫大,發(fā)育障礙及嚴(yán)重的貧血,其平均紅細(xì)胞體積(MCV)增大,HbH包涵體含量增高。結(jié)論①HbH病以缺失型為主,HbCS復(fù)合HbH病在HPLC中可出現(xiàn)特異的HbCS峰。②高HbH包涵體含量以及α CS鏈在紅細(xì)胞膜上的聚集是造成HbCS復(fù)合HbH病患兒臨床表現(xiàn)比缺失型HbH病患兒嚴(yán)重的原因。

血紅蛋白H病;高效液相色譜技術(shù);臨床表現(xiàn)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1417)

血紅蛋白H病(HbH病)屬于α地中海貧血(α地貧),其產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是由于4個(gè)α基因中有3個(gè)缺失或缺陷。α鏈合成嚴(yán)重不足,相對(duì)過(guò)剩的β鏈自行聚合為4聚體即血紅蛋白H(HbH),HbH的性質(zhì)不穩(wěn)定,易形成包涵體,沉積于紅細(xì)胞內(nèi),使紅細(xì)胞的變形性和通透性發(fā)生改變,紅細(xì)胞在通過(guò)脾臟時(shí)易于被破壞,出現(xiàn)貧血等臨床癥狀。

HbH病可分為缺失型與非缺失型兩大類,缺失型HbH病在外周血中可檢出HbH。非缺失型HbH病在我國(guó)主要為血紅蛋白Constant Spring(HbCS)和血紅蛋白Quong Sze(HbQS)復(fù)合HbH病[1]。其外周血中除了有HbH外,還有HbCS或HbQS。HbCS屬于不穩(wěn)定血紅蛋白,易于降解,在一般的血紅蛋白電泳實(shí)驗(yàn)中不易檢出。用分子生物學(xué)的方法可以準(zhǔn)確診斷HbCS復(fù)合HbH病,但是分子生物學(xué)的方法操作較為復(fù)雜,對(duì)技術(shù)人員要求高,整個(gè)操作過(guò)程不易質(zhì)控與標(biāo)準(zhǔn)化,不適于在廣大臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展。我們用高效液相色譜的方法檢測(cè)HbH病患兒,并對(duì)他們的臨床表現(xiàn)及血液學(xué)參數(shù)進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2007年10月-2008年10月我院住院或門診貧血的患兒49例,男31例,女18例,年齡2-13歲,均為廣東籍,漢族,其間無(wú)親緣關(guān)系,按張之南《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》第二版[2],經(jīng)分子生物學(xué)診斷為HbH病。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)血液學(xué)檢查 用全自動(dòng)血細(xì)胞分析系統(tǒng)(Cell Dyn 1700,美國(guó)COULTER公司。)檢測(cè)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC),血紅蛋白(Hb),紅細(xì)胞平均體積(MCV),紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH),紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)等紅細(xì)胞參數(shù)的測(cè)定。HbH包涵體測(cè)定按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]進(jìn)行。

1.2.2 Hb高效液相色譜(HPLC)分析 取EDTA抗凝血2 ml(BD抗凝管)無(wú)須制備溶血液直接上高效液相色譜儀(VARIANT Ⅱ,美國(guó) Bio-Rad公司。)分析。按儀器說(shuō)明書操作,血紅蛋白各成份定量約7分鐘后由HPLC分析儀自動(dòng)分析計(jì)算。

1.2.3 3種缺失型α地貧基因(--SEA,-α4.2,-α3.7)分析 采用跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)(Gap-PCR)方法進(jìn)行,具體步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

1.2.4 2種非缺失型α地貧基因(HbCS,HbQS)分析采用反向點(diǎn)雜交方法進(jìn)行,具體步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

2 結(jié)果

圖1 HbH病患兒HPLC圖譜

2.2 HbCS復(fù)合HbH病患兒的臨床表現(xiàn)較缺失型HbH病患兒嚴(yán)重,其患兒脾臟腫大,依賴輸血的比例均高于缺失型HbH病患兒,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 缺失型與非缺失型HbH病患兒均表現(xiàn)出小細(xì)胞低色素性貧血,但程度有所差異。HbCS復(fù)合HbH病患兒的貧血程度,MCV,以及HbH包涵體的水平均高于缺失型HbH病患兒。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 缺失型與非缺失型HbH病患兒臨床表現(xiàn)的比較

表2 兩組患兒血液學(xué)參數(shù)的比較(±s)

表2 兩組患兒血液學(xué)參數(shù)的比較(±s)

注:與缺失型HbH病比較:1)P＜0.05,2)P＜0.01

血液學(xué)檢查 缺失型HbH病 HbCS復(fù)合HbH病RBC(×1012/L) 4.77±0.71 3.47±1.071)Hb(g/L) 98.0±11.0 71.0±9.02)MCV(fl) 67.1±7.1 77.7±5.72)MCH(pg) 19.9±1.4 20.2±1.8 MCHC(g/L) 296.6±19.3 260.0±13.72)HbH包涵體(%) 20.2±4.7 70.3±7.11)

3 討論

HbH病的分子遺傳學(xué)機(jī)制有異質(zhì)性,其分子缺陷的背景十分復(fù)雜,具有種族和地域差異[6]。本文對(duì)49例HbH病患兒的檢測(cè)表明,HbH病以缺失型為主(77.7%),非缺失型HbH病主要為HbCS復(fù)合HbH病,占HbH病的一小部分(22.3%)。

本研究的臨床資料HbCS復(fù)合HbH病患兒的臨床表現(xiàn)要比缺失型HbH患兒嚴(yán)重。血液學(xué)指標(biāo)亦支持這一觀點(diǎn):此類患兒的Hb含量低于缺失型HbH病患兒,紅細(xì)胞MCV增大,紅細(xì)胞內(nèi)HbH包涵體含量遠(yuǎn)高于缺失型HbH病患兒。近來(lái)有研究HbH包涵體是引起組織缺氧的原因,其含量與紅細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)[7]。與此同時(shí),HbCS復(fù)合HbH病患兒同缺失型HbH病患兒相比,除了有高水平的HbH包涵體含量外,還有多余的α CS鏈。α CS鏈在紅細(xì)胞膜上的聚集可損害紅細(xì)胞膜上的Na-K聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)通道,其氧化產(chǎn)物還會(huì)與紅細(xì)胞膜上的骨架蛋白發(fā)生作用,造成紅細(xì)胞膜的水化改變,破壞紅細(xì)胞膜對(duì)紅細(xì)胞MCV的調(diào)節(jié)作用,使紅細(xì)胞MCV增大,進(jìn)而使紅細(xì)胞膜的脆性增大,變形能力變差,在通過(guò)脾竇毛細(xì)血管時(shí)易于被破壞而造成溶血[8]。我們認(rèn)為正是這兩個(gè)原因,造成了HbCS復(fù)合HbH病患兒的臨床表現(xiàn)比缺失型HbH病患兒嚴(yán)重。臨床上正確區(qū)分HbH病類型對(duì)指導(dǎo)HbH病的治療與預(yù)后判斷非常重要。

分子生物學(xué)方法是檢測(cè)HbH病的金標(biāo)準(zhǔn),雖然準(zhǔn)確,但對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高,對(duì)技術(shù)要求嚴(yán)格,實(shí)驗(yàn)過(guò)程較復(fù)雜,不易進(jìn)行質(zhì)控,廣泛用于臨床檢測(cè)有一定的困難,國(guó)內(nèi)大多數(shù)臨床醫(yī)院對(duì)HbH病的診斷多依靠電泳的方法。

由于HbCS屬于不穩(wěn)定血紅蛋白,易于降解,應(yīng)用血紅蛋白電泳的方法經(jīng)常有漏診。HPLC是以物理化學(xué)原理為主的分離分析方法,分離率高,可把理化性質(zhì)相差很小的混合物通過(guò)分離技術(shù),使微小差異的各組分分離。在分離的同時(shí),根據(jù)出峰位置可以定性,根據(jù)峰面積可以定量。靈敏度高,選擇性高,特別適用于生物大分子如各種血紅蛋白組分的分離,對(duì)HbH病及HbCS復(fù)合HbH病診斷的敏感性要遠(yuǎn)高于電泳的方法[9]。且所需標(biāo)本量少,標(biāo)本無(wú)需前處理,操作簡(jiǎn)單,能最大限度地消除人為誤差,數(shù)分鐘即可出結(jié)果,滿足了臨床上對(duì)缺失型HbH病與HbCS復(fù)合HbH病快速診斷的要求。

[1]趙永忠,徐湘民,楊 陽(yáng).應(yīng)用溫度梯度凝膠電泳分析非缺失型α地中海貧血突變[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2001,18:51.

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[3]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜主編.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].東南大學(xué)出版社,第3版,2006,186.

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The automated chromatography and clinical hematology analysis of hemoglobin H disease

ZHANG Li,OU Xiao-bing,YAN Mu-xia.(Department of Hematology,GuangZhou Children's Hospital,Guangzhou510120,China)

ObjectiveHemoglobin H disease(HbH)is the most severe type among survivors of αthalassemia.The aim of this study is to analyze the characterization of HbH disease in Gign performance liquid chromatography(HPLC)and clinical hematology and investigate the causes.MethodsForty-nine children with HbH disease or hemoglobin Constant Spring(HbCS)combined with HbH disease(HbH/CS)in GuangDong province were examined by using HPLC technique.All detailed clinical data of the caseswere recorded and all hematological findingswere evaluated.Results①In the HbH disease child,a HbH peak was present in the chromatogram and in the HbH/CS disease child,a HbH and a HbCS peak were present inthe chromatogram.Of these forty(nine children,thirty(eight(77.7%)were detected to be HbH disease and eleven(22.3%)were detected to be HbH/CS disease.②Comparedwith HbH disease children,HbH/CS disease children hadmarked spleen enlargement,thalassemic bone changes and severe anemia.Conclusion①Deletional type HbH disease was prevalent in these cases.HbH/CS disease demonstrated a characteristic HbCS peak in HPLC.②More severe clinical manifestation of HbH/CS disease children were related to significant higher HbH inclusion levels and the accumulation of α CS chains on the red blood cell membrane.

Hemoglobin H disease;High performance liquid chromatography;clinical manifestation

R331.1

A

1007-4287(2010)09-1417-03

廣州市衛(wèi)生局科研基金(30307-2080050)

*通訊作者

2010-02-19)