人血清IgG類抗LDH-C4抗體的ELISA檢測(cè)及其意義

陳 平,蘭風(fēng)華*,辛 娜,張 朵,陳 勇,蘇東輝

(1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心,福建福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系,福建福州 350004)

人血清IgG類抗LDH-C4抗體的ELISA檢測(cè)及其意義

陳 平1,蘭風(fēng)華1*,辛 娜1,張 朵1,陳 勇1,蘇東輝2

(1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心,福建福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系,福建福州 350004)

目的建立檢測(cè)人血清IgG類抗精子特異性乳酸脫氫酶(LDH-C4)抗體的ELISA法,探討人血清抗LDH-C4抗體與免疫性不育的關(guān)系。方法以重組人LDH-C4(rhLDH-C4)作為包被抗原,建立人血清IgG類抗LDH-C4抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。應(yīng)用該方法檢測(cè)74例健康人群(正常生育組)和177例不育人群(不育組)血清IgG類抗LDHC4抗體。結(jié)果初步建立了檢測(cè)人血清IgG類抗LDH-C4抗體的間接ELISA方法。不育組血清IgG類抗LDH-C4抗體陽(yáng)性率(30.51%)顯著高于正常生育組(9.46%)(P＜0.01),女性不育組陽(yáng)性率(31.46%)與男性不育組(29.55%)差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)論人血清中存在著IgG類抗LDH-C4抗體,此類抗體可能與免疫性不育有密切關(guān)系。

抗精子抗體;乳酸脫氫酶C4;免疫性不育;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1399)

精子特異性抗原與受精和胚胎的早期發(fā)育關(guān)系密切,在精子獲能、頂體反應(yīng)、精卵識(shí)別、精子穿過(guò)透明帶、精卵融合以及受精卵分裂等過(guò)程中起重要作用[1]。其中,部分抗原(如FA-1、LDH-C4、PH-20等)在一定條件下可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性自身抗體,影響精子的受精能力,從而導(dǎo)致免疫性不育。有學(xué)者用不育患者血清中提取的抗精子抗體(antisperm antibodies,ASA)對(duì)睪丸cDNA文庫(kù)表達(dá)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)最具特征性、最有效的精子特異性抗原為精子特異性乳酸脫氫酶,即乳酸脫氫酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4),該蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗生育作用已在多種哺乳動(dòng)物(包括靈長(zhǎng)類)得到驗(yàn)證[2]。到目前為止,國(guó)內(nèi)外很少有人對(duì)不育患者血清中抗LDH-C4抗體水平進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 血清

1.1.1 不育組血清 共177份,取自2005年8月-2006年1月間就診于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的不明原因不育患者,年齡23-50歲,男性88例,女性89例。

1.1.2 生育組血清 共74份,取自同期在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院體檢中心的體檢健康者,均已生育,年齡30-45歲,男性35例,女性39例。

1.1.3 處女血清 25份,由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院檢驗(yàn)科提供,年齡＜10歲。

1.1.4 已知陽(yáng)性和陰性血清 以純化的rhLDH-C4抗原為基質(zhì),對(duì)不育患者血清行免疫印跡檢查。選取其中對(duì)rhLDH-C4反應(yīng)性較強(qiáng)的血清作為已知陽(yáng)性血清。處女血清中,經(jīng)同樣方法,證實(shí)對(duì)rhLDHC4無(wú)反應(yīng)性的血清,當(dāng)作已知陰性血清。

1.2 重組hLDH-C4抗原的制備 取異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的重組菌BL21(DE3)(帶重組質(zhì)粒pET28a-hLDHC,本室構(gòu)建)菌液1 000 ml離心,收集菌體,重懸于10 ml結(jié)合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH8.0)中。加入 Triton X-100 100μ l和溶菌酶(10 mg/ml)100 μ l,并加入DNA 酶Ⅰ ,在液氮中和37℃恒溫水浴箱中反復(fù)凍融4次,以裂解菌體。4℃條件下,14 000 r/min,離心10 min收集上清。按照His-Tag融合蛋白純化試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)說(shuō)明書進(jìn)行條件優(yōu)化后,用Ni螯和層析柱對(duì)上清中的重組hLDH-C4(rhLDH-C4)進(jìn)行分離純化,用PIERCE公司蛋白定量試劑盒測(cè)定其含量。

1.3 間接ELISA方法 在微量板上,將rhLDHC4抗原用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH9.6)稀釋成1 μ g/ml,每孔加 100 μ l,4℃過(guò)夜 ,用 PBST(1XPBS,0.05%吐溫-20,pH7.4,以下同)洗滌3次。用封閉液(4%BSA-PBS)于37℃封閉2 h。加入1∶100稀釋的待檢血清,并用已知陰性和陽(yáng)性血清作對(duì)照,37℃1 h。洗滌后加入稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體(SBA公司產(chǎn)品),37℃作用1 h后洗滌。加底物TMD(四甲基聯(lián)苯胺)溶液,37℃避光反應(yīng)20 min,用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定各孔的吸光度值。

1.4 酶標(biāo)抗體最適工作濃度的確定 用100 ng/ml人IgG(Sigma公司產(chǎn)品)包被酶標(biāo)板,與作一系列稀釋的酶標(biāo)抗體反應(yīng)后,在波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)其吸光度值(A450 nm),見(jiàn)在稀釋度為1∶20 000時(shí),A450 nm約為1.0,故確定1∶20 000為酶標(biāo)抗體最適稀釋度[3]。

1.5 抗原最適包被濃度的確定 rhLDH-C4抗原分別以 0.125 μ g/ml、0.25 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml和 4 μ g/ml濃度包被酶標(biāo)板,陰性 、陽(yáng)性對(duì)照血清標(biāo)本按1∶100稀釋,酶標(biāo)抗體工作濃度為1/20 000。當(dāng)包被抗原濃度為 1.000 μ g/ml時(shí),陽(yáng)性對(duì)照的A450 nm＞0.1,陰性對(duì)照的A450 nm＜0.1,且兩者比值(2.812)最大,故選擇1 μ g/ml作為實(shí)際抗原包被。

1.6 血清標(biāo)本的檢測(cè) 用上述ELISA方法,對(duì)74份生育組血清、177份不育組男女血清中IgG類抗LDH-C4抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 χ2檢驗(yàn)(α=0.05),分別比較不育組與生育組之間的陽(yáng)性率差異,以及男性不育組與女性不育組之間的陽(yáng)性率差異。

2 結(jié)果

2.1 rhLDH-C4抗原的純化

1 000 ml菌液經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及純化后,得1.5ml、濃度為1.0 mg/ml的rhLDH-C4制備液。取約5 μ g純化蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳,純化蛋白僅顯示單一區(qū)帶,分子量位于45 μ與30 μ之間,與預(yù)期相符(hLDH-C4分子量約為35 μ,圖1)。

圖1 純化rhLDH-C4的聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.2 間接ELISA方法的建立

2.2.1 陽(yáng)性切割值的確定

以處女組血清標(biāo)本A450 nm值的平均值加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(s)作為陽(yáng)性切割值(cut-off value),A450 nm值≥陽(yáng)性切割值判定為陽(yáng)性,A450 nm值＜陽(yáng)性切割值判定為陰性[4]。rhLDH-C4抗原以 1 μ g/ml包被,酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶20 000,測(cè)定25例女童血清標(biāo)本的A450 nm值,計(jì)算其平均值為0.042,s為0.027,故算得陽(yáng)性切割值為0.123。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取陰性和陽(yáng)性的血清標(biāo)本各一份,分別同時(shí)作4次測(cè)定,測(cè)得A450 nm值的批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.89%和5.02%。另外,連續(xù)4天測(cè)定同一份陰性血清標(biāo)本和陽(yáng)性血清,計(jì)算A450 nm值批間差異,變異系數(shù)分別為8.51%和1.92%。

2.3 血清標(biāo)本的檢測(cè)

以74例生育者血清標(biāo)本作為正常對(duì)照,用上述建立的間接ELISA方法檢測(cè)177例不育者血清IgG類抗LDH-C4抗體,陽(yáng)性率為30.51%(54/177),而對(duì)照組僅為9.46%(7/74),兩組的陽(yáng)性率有極顯著差異(χ2為12.57,P＜0.01)。此外,在 177例不育患者者中,男性患者陽(yáng)性率為29.55%(26/88),女性患者陽(yáng)性率為31.46%(28/89),陽(yáng)性率差異不顯著(χ2為0.08,P＞0.05)。

3 討論

眾多的研究證實(shí),LDH-C4抗原是影響生育過(guò)程的一種關(guān)鍵的精子特異性抗原,與精子的生成、代謝、獲能等有密切關(guān)系[5]。人工免疫LDH-C4抗原可在多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)抗LDH-C4抗體產(chǎn)生,后者可導(dǎo)致動(dòng)物的生育率明顯下降[6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用純化的rhLDH-C4抗原作為包被抗原,確定了最適抗原包被濃度及陽(yáng)性切割值,優(yōu)化檢測(cè)條件,初步建立了檢測(cè)人血清IgG類抗LDH-C4抗體的間接ELISA方法。試驗(yàn)顯示,該法的批內(nèi)及批間差異均＜10%,具有良好的重復(fù)性。

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法,對(duì)不育患者血清中IgG類抗LDH-C4抗體水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:男女不育組血清IgG類抗LDH-C4抗體陽(yáng)性率高達(dá)30.51%,而對(duì)照組僅為9.46%,提示人血清抗LDH-C4抗體可能與不育癥具有密切關(guān)系。另外,對(duì)照組少數(shù)標(biāo)本抗LDH-C4抗體也出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,可能原因是:本研究的對(duì)照組標(biāo)本均來(lái)自生育后的夫婦,其抗體陽(yáng)性可能發(fā)生于孕后或生育后——既往有生育史不等于取樣當(dāng)時(shí)或其后生育力不受抗體影響。另外,不育可能與抗體滴度有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為,血清中ASA陽(yáng)性需看其滴度高才有臨床意義,低滴度的ASA不影響生育[7]。換言之,低滴度的抗LDHC4抗體可能不足以完全阻斷生育。

在177例男女不育患者中,男性患者陽(yáng)性率為29.55%,女性患者陽(yáng)性率為31.46%,兩者無(wú)顯著差別。這項(xiàng)結(jié)果顯示,不管是男方或者女方產(chǎn)生抗LDH-C4抗體都可能導(dǎo)致不育。在男性方面,精液中存在抗LDH-C4抗體時(shí),該抗體可能在男性生殖道通過(guò)抑制精子上LDH-C4的酶活性,降低男性精液的質(zhì)量,導(dǎo)致精子活力減弱、穿透力降低,從而阻礙精子在女性生殖道的穿行;在女性方面,女方生殖道分泌液(如宮頸黏液、卵泡液等)中存在抗LDH-C4抗體時(shí),不同類型的抗體(尤其是分泌型IgA)結(jié)合到精子表面上,通過(guò)凝集或制動(dòng)作用,顯著地降低精子對(duì)宮頸黏液的穿透力及精子在子宮輸卵管的運(yùn)行,從而干擾精卵結(jié)合,甚至有可能影響到受精卵的著床和發(fā)育。

本研究建立的抗LDH-C4抗體間接ELISA法與臨床上常規(guī)使用的ASA斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾檢測(cè)法進(jìn)行了初步比較(結(jié)果略),觀察到ASA斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾檢測(cè)法陽(yáng)性率低于抗LDH-C4抗體間接ELISA法,且ASA檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本,抗LDH-C4抗體檢測(cè)未必一定陽(yáng)性,反之亦然。由于目前臨床上ASA檢測(cè)試劑盒所用的抗原基質(zhì)是精子抗原粗提物,成分多,針對(duì)其中大部分精子抗原的ASA與免疫性不育關(guān)系不大,部分與不育密切相關(guān)的抗原成分在所用的抗原基質(zhì)中含量偏低,因此,ASA檢測(cè)的敏感性及特異性不高,檢測(cè)結(jié)果的臨床意義有限。本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法是以單一精子特異性rhLDH-C4作為包被抗原,僅針對(duì)血清抗LDH-C4抗體進(jìn)行檢測(cè),避免了非特異蛋白成分的干擾,提高了檢測(cè)的敏感性及特異性。

本研究首次研究了以rhLDH-C4作為ELISA包被抗原檢測(cè)血清抗LDH-C4抗體的可行性,并首次對(duì)不育患者血清中IgG類抗LDH-C4抗體進(jìn)行檢測(cè)。由于目前國(guó)內(nèi)外尚未建立免疫性不育的診斷標(biāo)準(zhǔn),也未制備抗LDH-C4抗體的標(biāo)準(zhǔn)人血清,該方法的敏感性及特異性有待以后研究進(jìn)一步驗(yàn)證。盡管如此,該方法的建立將為其它抗精子特異性抗原抗體檢測(cè)方法的建立提供有益的借鑒。

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[4]沈關(guān)心,周汝麟主編.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,1998.119.

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ELISA method for detection of IgG-type anti-sperm specific lactate dehydrogenase antibody in human sera and its clinical significance

CHEN Ping,LAN Feng-hua,XIN Na,et al.(ResearchCenterfor MolecularMedicine,Fuzhou General Hospital of Nanjing Command,PLA,Fuzhou,Fujian350025,China)

ObjectiveTo establish an ELISA method for the detection of IgG-type anti-sperm specific lactatedehydrogenase antibody in human sera and investigate the relationshipbetween anti-sperm specific lactate dehydrogenase antibody and immune infertility.MethodsAn indirect ELISA was established using recombinant human sperm-specific dehydrogenase(rhLDH-C4)antigen for plate coating and anti-LDH-C4 antibody(IgG type)in the sera from 74 fertile individuals(fertile group)and 177 unexplained infertile patients(infertile group)was detected.ResultsAn indirect ELISA method for detecting IgG type anti-LDH-C4 antibody in human sera was established.Of 177 infertile patients(in infertile group),54 were found positive for serum IgG type anti-LDH-C4 antibody,resulting in a positive ratio of 30.51%(54/177),which was significantly higher than that in fertile group(7/74 or 9.46%,P＜0.01).Within the infertile group,no significant difference of positive ratios were observed between female and male members(31.46%vs 29.55%,P＞0.05).ConclusionThere was IgG-type anti-LDH-C4 antibody in human sera,and this antibody might be closely related to infertility.

sperm;lactate dehydrogenase;infertility;IgG;ELISA

R446.62;R711.6

A

1007-4287(2010)09-1399-03

福建省科技攻關(guān)重點(diǎn)課題(2002Y032)

*通訊作者

陳 平(1979-),男,碩士研究生,從事免疫學(xué)研究。

2009-12-15)