細(xì)胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因酶切圖譜分析

魏榮旋,趙 慶,王 和

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬三院 檢驗(yàn)中心,貴州 遵義 563002;2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院微生物教研室,貴州 貴陽(yáng) 550004)

細(xì)胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因酶切圖譜分析

魏榮旋1*,趙 慶1,王 和2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬三院 檢驗(yàn)中心,貴州 遵義 563002;2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院微生物教研室,貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的探討細(xì)胞壁缺陷對(duì)淋病奈瑟菌隱蔽性質(zhì)粒B(cppB)基因的影響以及細(xì)胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB的變異特點(diǎn)。方法用青霉素誘導(dǎo)淋病奈瑟菌成為細(xì)胞壁缺陷型并獲得其純培養(yǎng)物,cppB基因特異性引物PCR檢測(cè)細(xì)胞壁缺陷型純培養(yǎng)物的cppB基因,并對(duì)其cppB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析。結(jié)果細(xì)菌型和細(xì)胞壁缺陷型均具有 cppB基因擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶HindⅢ、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ消化和電泳,在 5%PAGE凝膠電泳中,呈現(xiàn)出相同的電泳條帶。結(jié)論淋病奈瑟菌細(xì)菌型及其細(xì)胞壁缺陷型對(duì)cppB基因限制性核酸內(nèi)切酶(HindⅢ、HinfⅠ、MspⅠ、HpaⅡ)的分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)淋病奈瑟菌L型具有與其親代細(xì)菌型不同的圖譜,提示細(xì)胞壁缺陷沒(méi)有導(dǎo)致淋病奈瑟菌的cppB基因發(fā)生這些核酸酶切位點(diǎn)中核苷酸序列的改變。

細(xì)胞壁缺陷型;淋病奈瑟菌;cppB基因;酶切

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1353)

細(xì)胞壁缺陷型(又稱細(xì)菌L型)是細(xì)菌最常發(fā)生的變異類型,它不僅導(dǎo)致細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生改變[1,2,3],同時(shí)也常常導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖、代謝活性、致病性、抗原性、抗生素敏感性、遺傳等方面特性的發(fā)生改變[4,5,6]。淋病奈瑟菌96%以上的菌株攜帶隱蔽性質(zhì)粒B(cppB)基因,即使在不含cppB的菌株的染色體也整合有攜帶隱蔽性質(zhì)粒B[3,6,7]。由于臨床治療淋病奈瑟菌的感染廣泛采用青霉素或β-內(nèi)酰類等抗生素進(jìn)行治療,發(fā)生細(xì)胞壁缺陷型淋病奈瑟菌的情況不可避免,用常規(guī)培養(yǎng)的方法難以檢測(cè)到病原菌,常常導(dǎo)致漏診或誤診。國(guó)際上常使用PCR檢測(cè)病員的分泌物或培養(yǎng)物cppB基因來(lái)鑒定淋病耐瑟菌或診斷淋病。也有文獻(xiàn)報(bào)道[3,9]細(xì)胞壁缺陷型細(xì)菌可發(fā)生攜帶的質(zhì)粒的丟失,甚至染色體基因序列也可以發(fā)生改變。為了進(jìn)一步探討細(xì)胞壁缺陷對(duì)淋病奈瑟菌cppB基因的影響、了解其變異的特點(diǎn),我們對(duì)淋病奈瑟菌L型(青霉素誘導(dǎo)形成)的cppB基因進(jìn)行PCR檢測(cè)、并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株(29106-6),北京中國(guó)藥品和生物制品鑒定所提供。

1.1.2 非高滲培養(yǎng)基 肝消化液,按文獻(xiàn)方法[4,5]制備。

1.1.3 誘導(dǎo)劑 青霉素G鈉注射液(批號(hào)

B20090525),由哈爾濱制藥總廠提供。

1.1.4 cppB PCR試劑盒 引物的堿基序列為:5,-CTTGGCTGGTTGATTCAAG-3,, 5,-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3,,由華美生物工程公司提供。

1.1.5 限制性內(nèi)切酶 HindⅢ切割位點(diǎn):5,…A↓AGCTT…3,,HinfⅠ切割位點(diǎn):5,…G↓ATTC…3,,HpaⅡ切割位點(diǎn):5,…C↓CGG…3,,MspⅠ切割位點(diǎn):5,…C↓CGG …3,,由華美生物工程公司提供。

1.2 方法

1.2.1 L型誘導(dǎo) 將淋病奈瑟菌接種于含5 ml肝消化液培養(yǎng)基的小方瓶?jī)?nèi),加入青霉素使其終濃度為15 u/ml。用膠塞蓋緊瓶口置普通溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng),在倒置顯微鏡高倍鏡下逐日觀察細(xì)菌型及L型的生長(zhǎng)情況。L型形成后取培養(yǎng)物經(jīng)0.22 μ m孔徑濾菌器過(guò)濾并接種0.5 ml濾過(guò)物于不含誘導(dǎo)劑的5 ml肝消化液培養(yǎng)基內(nèi),每5-7天傳一代培養(yǎng)獲得L型純培養(yǎng)物。每次傳代分別收集L型培養(yǎng)物,置-20℃冰箱內(nèi)保藏備用。

1.2.2 細(xì)菌型培養(yǎng) 將淋病奈瑟菌接種于不含誘導(dǎo)劑的5 ml肝消化液培養(yǎng)基的小方瓶?jī)?nèi),用膠塞蓋緊瓶口置普通溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。每天取細(xì)菌型培養(yǎng)物0.5 ml接種于不含誘導(dǎo)劑的5ml肝消化液培養(yǎng)基內(nèi)傳代培養(yǎng)和收集培養(yǎng)物置-20℃冰箱內(nèi)保藏備用。

1.2.3 cppB基因的PCR 根據(jù)淋病奈瑟菌PCR診斷試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的程序進(jìn)行。

1.2.4 cppB基因的酶切分析

1.2.4.1 淋病奈瑟菌細(xì)菌型和細(xì)胞壁缺陷型cppB基因PCR產(chǎn)物的純化 按文獻(xiàn)[5]提供的方法進(jìn)行。

1.2.4.2 cppB基因(純化后)的DNA含量的測(cè)定在紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)為260 nm和280 nm下分別測(cè)量其吸光度值,按文獻(xiàn)[8,9]提供的公式計(jì)算樣本的DNA含量。

1.2.4.3 限制性核酸內(nèi)切酶處理 按試劑盒推薦的程序,分別用HindⅢ 、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ對(duì)純化后的細(xì)菌型和細(xì)胞壁缺陷型的cppB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化。反應(yīng)體系為:

無(wú)菌去離子水 -10×Buffer 2μ l Acetylated BSA 2μ l DNA 底物 1μ g限制性內(nèi)切酶 2-4 μ l總體積 20μ l

1.2.4.4 取消化過(guò)的細(xì)菌型和細(xì)胞壁缺陷型淋病奈瑟菌的cppB基因PCR產(chǎn)物5 μ l分別加入等量的載樣緩沖液,各樣品加于5%PAGE凝膠樣品孔內(nèi),以電壓1-8 V/每cm膠距電泳10小時(shí),取出凝膠固定、銀染色、觀察結(jié)果并照相。

2 結(jié)果

2.1 淋病奈瑟菌cppB基因PCR結(jié)果 淋病奈瑟菌細(xì)菌型和細(xì)胞壁缺陷型(1-4代)樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳后,能夠觀察到與試劑盒陽(yáng)性對(duì)照一致的明顯的cppB基因條帶,但細(xì)胞壁缺陷型5代后培養(yǎng)物未能檢出陽(yáng)性DNA條帶。

2.2 cppB基因PCR產(chǎn)物限制性核酸內(nèi)切酶圖譜限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ不能切開(kāi)細(xì)菌型以及L型的cppB基因擴(kuò)增片段,HpaⅡ酶將細(xì)菌型和L型的cppB基因擴(kuò)增片段分別切開(kāi)為相同的兩條帶(圖1)。HinfⅠ不能切開(kāi)細(xì)菌型和L型的cppB基因擴(kuò)增片段。MspⅠ酶切細(xì)菌型和L型可將兩型細(xì)菌的cppB基因擴(kuò)增片段分別切開(kāi)為相同的兩條帶(圖2)。

圖1 淋病奈瑟菌 HindⅢ和 HpaⅡ酶切圖譜

圖2 淋病奈瑟菌HinfⅠ和MspⅠ酶切圖譜

3 討論

利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)型多態(tài)性(PCR-SSCP)、限制性核酸內(nèi)切酶等方法已廣泛用于核酸的組成及其同源性和特異性的研究[8,9]。限制性核酸內(nèi)切酶具有從分子內(nèi)部特異性切割核酸的作用,使用某種具有已知切割位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的基因或核酸進(jìn)行消化,通過(guò)對(duì)其產(chǎn)物的分子量、組成等分析可了解該基因或核酸的組成及其同源性。如果核酸的酶切位點(diǎn)發(fā)生改變,可以通過(guò)電泳技術(shù)觀察到不同的條帶,通常提示組成該基因或核酸的核苷酸序列發(fā)生了改變。

本文結(jié)果顯示淋病奈瑟菌穩(wěn)定L型的cppB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)四種核酸內(nèi)切酶分別消化及5%的聚丙酰胺凝膠電泳技術(shù)觀察到與其親代細(xì)菌型相同的條帶,提示淋病奈瑟菌穩(wěn)定L型暫時(shí)保留的cppB基因并沒(méi)有發(fā)生這些核酸酶切點(diǎn)中核苷酸序列的改變和仍然具有與其親代細(xì)菌型相同的核酸酶切點(diǎn)。結(jié)合文獻(xiàn)[10]資料,提示淋病奈瑟菌L型cppB基因的核苷酸序列可能發(fā)生微小的改變或點(diǎn)突變,但不是HindⅢ、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ這四個(gè)限制性核酸內(nèi)酶切位點(diǎn)的改變。

因此可以推斷:淋病奈瑟菌L型細(xì)菌的變異不是簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)表型變異,而可能是涉及到1個(gè)至數(shù)個(gè)核苷酸的改變以及最終導(dǎo)致隱蔽性質(zhì)粒cppB基因丟失[6,10]的遺傳型突變。

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Analysis of the Cryptic Plasmid B Gene of Cell Wall Deficient Neisseria gonorrhoeae by Restriction Enzyme Map

WEI Rong-xuan1*,ZHAOQing1,WANG He2.(1.The Laboratory Center,the3rd Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi563002,China;2.TheDepartment of Mic robiology,Guiyang Medical College,Guiyang550004,China)

Objective To probe influence of cellwall deficiency on the Cryptic PlasmidB gene of N.gonorrhoeae andits characteristic variation.MethodsThe N.gonorrhoeae was induced into L-form by penicillin and the cppB gene of the pure culture of L-form was determined by PCR and Restriction Enzyme(HindⅢ,HinfⅠ ,MspⅠ ,HpaⅡ).ResultsBy PCR,the cppB geneswere be found inboth the bacterial form and the L-forms of N.gonorrhoeae.There were same bands in the bacterial form and the L-forms by Restriction Enzyme Map.ConclusionThe Restriction Enzyme Mapswere not different in the bacterial form and the L-forms.These were shown that base alignment of cell wall deficiency on the Cryptic Plasmid B would not change by Restriction Enzyme of HindⅢ,HinfⅠ ,MspⅠand HpaⅡ.

L-form;N.gonorrhoeae;cppB gene;Restriction Enzyme Map

R372

A

1007-4287(2010)09-1353-03

*通訊作者

book=1354,ebook=415

2010-06-21)