重組腺病毒載體攜帶反義微小RNA-21對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

朱德淳,李然偉,劉祿成,溫都蘇,魏 巍

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,吉林長(zhǎng)春 130041)

重組腺病毒載體攜帶反義微小RNA-21對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

朱德淳,李然偉,劉祿成,溫都蘇,魏 巍

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,吉林長(zhǎng)春 130041)

目的探討重組腺病毒載體介導(dǎo)的微小RNA-21(miRNA-21)反義寡核苷酸(ASOND)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24生長(zhǎng)的影響。方法構(gòu)建反向插入miRNA-21基因的重組腺病毒載體(rAV-miRNA-21),并用反義rAV-miRNA-21轉(zhuǎn)染T24,即病毒載體用藥組。采用噻唑藍(lán)(MTT)法和原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)T24細(xì)胞的增殖和凋亡情況。同時(shí)設(shè)對(duì)照組和空病毒組作為對(duì)比。結(jié)果rAV-miRNA-21用藥組、對(duì)照組和空病毒組T24細(xì)胞的增殖率分別為(37.1±6.8)%、(95.7±5.8)%、(86.3±7.5)%;凋亡率分別是(31.6±4.7)%、(8.4±2.9)%、(7.3±4.6)%。 用藥組的增殖率和凋亡率分別與對(duì)照組和空病毒組相比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而對(duì)照組與空病毒組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論反義miRNA-21重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

膀胱腫瘤;微小 RNA-21;重組腺病毒;基因治療

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1351)

膀胱癌細(xì)胞能過度表達(dá)癌基因微小RNA-21(miRNA-21),其表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),高miRNA-21表達(dá)的患者預(yù)后不良[1,2]。本研究通過構(gòu)建反向攜帶miRNA-21基因的重組腺病毒載體(rAV-miRNA-21),觀察miRNA-21反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOND)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24增殖和凋亡的影響,從而為膀胱癌的基因治療尋找更為有效的新方法并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 人膀胱癌細(xì)胞株T24購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。腺病毒表達(dá)載體PDC316-EGFP-U6系統(tǒng)購(gòu)自本元正陽公司。限制性內(nèi)切酶等各種工具酶購(gòu)自BioLabs公司。反義和隨機(jī)對(duì)照寡核苷酸購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。反義miRNA-21 序列(AS-miRNA-21)為 5′CTCAACTGGTGTCGGCAACATCG3′,隨機(jī)對(duì)照序列為5′UCUACUCUUUCUAGGUUGUGA3′。在 Genbank中行 Blastn證實(shí)ASOND與任何已知哺乳動(dòng)物基因無匹配。反義miRNA-21重組腺病毒載體(rAV-miRNA-21)的制備方法參考文獻(xiàn)[3]。

1.2 方法 ①檢測(cè)反義rAV-EGFP對(duì)T24細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,每組3復(fù)孔,每孔細(xì)胞數(shù)為1×103個(gè),37℃培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)68 h后每孔分別加入含rAV-EGFP的培養(yǎng)液,37℃孵育4 h,輕輕吸去上清后分別用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察并測(cè)定熒光蛋白(EGFP)表達(dá)情況。②評(píng)價(jià)反義rAV-miRNA-21對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞,分別加入rAV-miRNA-21和rAV-MCS,68h后提取細(xì)胞基因組,PCR擴(kuò)增反義miRNA-21目的片段,凝膠電泳正確后測(cè)序,測(cè)序正確后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞,相差顯微鏡觀察感染細(xì)胞變化,MTT染色及電鏡觀察細(xì)胞狀態(tài),最后用MTT比色法檢測(cè)T24細(xì)胞增殖率。③測(cè)定反義rAV-miRNA-21誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡率:按照反義rAV-miRNA-21組(病毒載體用藥組),rAV-MCS組(空病毒組)和空白對(duì)照組分為3組。每組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板,每組3復(fù)孔,每孔細(xì)胞數(shù)為1×103個(gè),37℃培養(yǎng)24 h后輕輕吸去上清。每組分別加進(jìn)rAV-miRNA-21、rAV-MCS和生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)68 h后每孔分別加TUNEL反應(yīng)液,37℃孵育4 h后棄上清。用原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)T24細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取3孔平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,組間差異比較用 t檢驗(yàn),結(jié)果用±s表示,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rAV-EGFP對(duì)T24細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 rAV-EGFP轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞68h后用熒光顯微鏡看到大量細(xì)胞表達(dá)有綠色熒光蛋白編碼基因(EGFP)的腺病毒,熒光蛋白表達(dá)率接近100%,綠色熒光分布在以細(xì)胞核為主的整個(gè)細(xì)胞中,見圖1。

圖1 綠色熒光蛋白(EGFP)在T24細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

2.2 rAV的生物活性 在T24細(xì)胞被轉(zhuǎn)染病毒顆粒68 h后提取細(xì)胞基因組,PCR擴(kuò)增目的基因片段,1%凝膠電泳見到大約1.5 Kb長(zhǎng)的基因片段,測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致。提示反義rAV-miRNA-21能夠感染T24細(xì)胞,具有生物活性,見圖2。

圖2 反義 miRNA-21重組腺病毒在T24細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

2.3 T24細(xì)胞增殖率 MTT比色法分別檢測(cè)反義rAV-miRNA-21組、rAV-MCS組和空白對(duì)照組T24細(xì)胞增殖率。3組結(jié)果見表1。rAV-miRNA-21組和另外兩組間分別比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而rAV-MCS和對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明反義rAV-miRNA-21具有抑制T24細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。

2.4 T24細(xì)胞凋亡率 TUNEL法檢測(cè)3組T24細(xì)胞凋亡率的結(jié)果見表1。顯示病毒載體用藥組分別與空病毒組和空白對(duì)照組相比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而空病毒組與空白對(duì)照組比較,詫異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示反義rAV-miRNA-21在單細(xì)胞水平可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,見圖3。

表1 各組 T24細(xì)胞增殖率和凋亡率的比較(±s)

表1 各組 T24細(xì)胞增殖率和凋亡率的比較(±s)

注:與rAV-MCS組比較,※P＜0.01;與空白對(duì)照組比較,△P＜0.01

組別 n T24細(xì)胞增殖率(%)T24細(xì)胞凋亡率(%)反義 rA V-miRNA-21組 50 37.1±6.8※△ 31.6±4.7 rAV-MCS組 30 86.3±7.5 8.4±2.9空白對(duì)照組 30 95.7±5.8 7.3±4.6

3 討論

微小RNA(miRNA)參與細(xì)胞增殖和凋亡,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用。miRNA-21是最常見的表達(dá)上調(diào)miRNA,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而加速腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用。miRNA-21的這些作用,主要是通過調(diào)控程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)和抑癌基因(PTEN)及TPM1來實(shí)現(xiàn)[4-6]。由于上述促凋亡因子和抑癌基因與膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān),所以我們通過觀察重組腺病毒載體攜帶反義miRNA-21對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡的影響,探索以miRNA-21為靶點(diǎn)治療膀胱癌的可能性。

圖3 TUNEL法檢測(cè)不同3組T24細(xì)胞凋亡率結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染反義rAV-miRNA-21的T24細(xì)胞增殖率降低,凋亡率增加與未轉(zhuǎn)染反義rAV-miRNA-21的空病毒組和空白對(duì)照組的T24細(xì)胞增殖率和凋亡率分別比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而未轉(zhuǎn)染反義rAV-miRNA-21的兩組相比較,差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示:①膀胱癌組織中存在miRNA表達(dá)失衡,對(duì)高表達(dá)miRNA-21的膀胱癌細(xì)胞,可以通過反義技術(shù)有效抑制;②利用miRNA-21模擬物或阻礙物,通過轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞可能有助于抑制腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。這為以miRNA-21為目標(biāo)的膀胱癌靶向基因治療提供了新的初淺的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Neely LA,RiegerChrist,Neto BS,et al.A microRNA expressionratio defining the invasive phenotype in bladder tumor[J].Urol Oncol,2008,15:155.

[2]Zhu S,Si ML,Wu H,et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin[J].J Biol Chem,2007,19:14328.

[3]So A,Rocchi P,Gleave M.Antisense oligonucleotide therapy in the management of bladder cancer[J].CurrOpin Urol,2005,15:320.

[4]Li T,Li D,Sha J,et al.MicroRNA-21 directly targets MARCKS and promotes apoptosis resistance and invasion in prostate cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,383(3):280.

[5]Huang GL,Zhang XH,Guo GL,et al.Clinical signifcance of miRNA-21 expression in breast cancer[J].Oncol Rep,2009,21(3):673.

[6]Zhu S,Si ML,Wu H,et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin1(TPM1)[J].J Biol Chem,2007,282(19):14328.

Recombinant adenovirus vector with antisense miRNA-21 affect bladder cancer cell growth

ZHU De-chun,LI Ran-wei,LIU Lu-cheng,et al.(Department of Urology,The Second Hospital of Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectiveTo explore miRNA-21 antisense oligonucleotide mediated by recombinant adenovirus vector affect human bladder cancer cell line T24 growth.MethodsTo construct inverted insertion miRNA-21gene recombinant adenovirus vector(rAV-miR NA-21),and use rAV-miRNA-21 transfect T24,that is viral vector medication group.Adopting MTT and TUNEL detect proliferation and apoptosis status.Simultaneously set up control group and take vacancy viral group as comparison.ResultsThe T24 growth rates of rAV-miRNA-21group、control groupand vacancy viral group are(37.1±6.8)%,(95.7±5.8)%and(86.3±7.5)%,the apoptosis rates are(31.6±4.7)%,(8.4±2.9)%and(7.3±4.6)%.Compare proliferation and apoptosis of rAV-miRNA-21 group miRNA-21 groupwith control group and vacancy viral group,difference has statistical significance(P＜0.05),but between control group and vacancy viral group difference has nonsignificance(P＞0.05).ConclusionAntisense miRNA-21 recombinant adenovirus vector transfect T24 couldinhibit proliferation of tumor cell and increase tumor cell apoptosis,and so inhibit bladder cancer cell growth.

bladder cancer;miRNA-21;recombinant adenovirus;gene therapy

R735.14

A

1007-4287(2010)09-1351-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(30972981)

朱德淳,53歲,男,碩士生導(dǎo)師,教授,主要從事泌尿腫瘤的早期診斷和治療研究。

2010-01-05)