δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡及肺組織Bcl-2、Caspase-3表達的影響

余歡明，馮文明，王耀

δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡及肺組織Bcl-2、Caspase-3表達的影響

余歡明，馮文明，王耀

目的：觀察δ阿片受體激動劑DADLE對膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡及肺組織Bcl-2、Caspase-3表達的影響。方法：采用盲腸結扎加穿孔(CLP)法制作大鼠膿毒癥模型，SD大鼠54只隨機分為CLP組、DADLE組和假手術（SHAM）組。在不同時間點(12 h、36 h、72 h)處死大鼠，原位末端標記檢測肺組織細胞凋亡情況，免疫組化法檢測肺組織中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的動態(tài)變化并比較肺組織的病理改變。結果：CLP組大鼠肺組織病理損害較SHAM組明顯加重，DADLE組肺組織的病理變化明顯減輕；CLP組大鼠肺組織細胞凋亡指數較SHAM組明顯升高（P<0.01），以36 h組最明顯（P<0.01）。結論：DADLE明顯改善膿毒癥大鼠肺組織的病理變化，可能與DADLE下調Caspase-3表達、上調Bcl-2表達，從而抑制肺組織細胞凋亡有關。

δ阿片受體激動劑；膿毒癥；凋亡；Bcl-2；Caspase-3

研究表明，膿毒癥時急性肺損傷時肺組織內大量細胞發(fā)生凋亡[1]。細胞凋亡受一系列基因的控制，其中Bcl-2基因是膿毒癥后細胞凋亡關系最密切的凋亡調控基因之一[2]。本研究旨在通過動態(tài)觀察δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響，探討δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠急性肺損傷保護的可能機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級雌雄不拘SD大鼠，體重190～210 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。1.2主要試劑D-丙2,D-亮5腦啡肽（[D-Ala2, D-Leu5]-enkephali，DADLE）由美國SIGMA公司提供。TUNEL試劑盒由德國Bochringer Mannheim公司提供。兔抗Bcl-2抗體、鼠抗Caspase-3抗體由美國Sant Cruz公司提供。SP免疫組化試劑盒由北京中山生物技術公司提供。

1.3 實驗分組將54只SD大鼠（雌雄不拘）按隨機數字表法分為3組：盲腸結扎加穿孔（CLP）組、DADLE組和假手術（SHAM）組各18只。根據不同時間點(12 h、36 h、72 h)又分為3個對應的亞組(n=6)。

1.4 模型制備按照常規(guī)方法行CLP，復制嚴重腹腔感染膿毒癥模型。大鼠稱重，編號，并禁食12 h，自由飲水。麻醉后固定，消毒，鋪無菌巾。沿腹正中線切口，暴露盲腸并于根部結扎，用16號穿刺針貫通穿刺盲腸3次形成腸瘺，將盲腸還納腹腔，逐層縫合切口。皮下注射10 mL生理鹽水，術后自由飲水。SHAM組僅開腹，分離盲腸遠端與大腸系膜后關腹，即除盲腸不結扎穿孔外，其余處理與各組保持一致。SHAM組及CLP組在手術前0.5 h分別給予10 mL/kg的生理鹽水腹腔注射；DADLE組術前0.5 h分別給予10 mL/kg的DALDE腹腔注射（濃度為0.5 mg/mL）。于預定的時間點（12、36、72 h）斷頭處死存活大鼠。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 肺組織的病理組織學檢查取肺組織約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，用10%甲醛液固定后，石蠟包埋，切片4～5μm厚，脫蠟后常規(guī)行HE染色。

1.5.2 原位末端標記法檢測肺組織細胞凋亡采用TUNEL法檢測，按試劑盒說明書操作：⑴固定包埋，切片；⑵脫蠟；⑶消化膜蛋白及核蛋白(20 mg/L蛋白酶K室溫消化15 min，蒸餾水洗3次；3 mL/L甲醇雙氧水室溫下10 min，PBS洗5 min×3次)；⑷加TUNEL反應混合物,37℃，60 min，PBS中洗5 min×3次；⑸加入過氧化物酶連接的抗熒光抗體,37℃，30 min，PBS洗5 min×3次；⑹加入底物顯色10 min；⑺蘇木素復染、脫水、封片。細胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細胞，計算5個高倍視野（×400）下的凋亡細胞數，以每百個細胞中的凋亡細胞數表示凋亡指數。

1.5.3 免疫組化檢測肺組織的Bcl-2、Caspase-3蛋白表達兔抗Bcl-2抗體、鼠抗Caspase-3抗體稀釋度均為1∶100。分別用等稀釋度的兔抗及鼠抗IgG做陰性對照。切片依次二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%過氧化氫孵育10 min，三蒸水洗3次，每次5 min。PBS浸泡5 min,微波爐抗原修復15 min。自然冷卻至室溫。滴加羊封閉血清，室溫孵育1 h，傾去勿洗。滴加1∶100的一抗（分別為Bcl-2或Caspase-3），放入4℃冰箱過夜。PBS沖洗3次，每次5 min，擦凈切片周圍水分后，滴加親和素標記的二抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素工作液，放入37℃溫箱孵育20 min。PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色，脫水、透明、封片。切片采用LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)(Leica公司，德國)進行圖像分析。每張切片取CA1區(qū)中1/3段測量平均灰度值，然后減去此片背景平均灰度值，取其相反數作為最終光密度值(OD)。Bcl-2和Caspase-3蛋白的免疫組化結果判斷[3]：⑴陰性(-)，細胞漿內無染色；⑵陽性(+)，細胞內見黃色顆粒；⑶中等陽性(++)，細胞漿內見較深棕黃色顆粒；⑷強陽性(+++)，細胞內見大量深棕黃色顆粒。在顯微鏡下隨機選擇10個區(qū)域，每個區(qū)域統(tǒng)計100個細胞，將每個區(qū)域中Bcl-2、Caspase-3陽性的細胞數相加，即為Bcl-2、Caspase-3的陽性表達率。

2 結果

2.1 各組中死亡大鼠的處理本實驗各組大鼠12 h前無死亡；12～36 h間CLP組死亡1只；36～72 h間CLP組死亡2只，DADLE組死亡1只。

2.2 肺臟的病理組織學觀察光鏡下見肺泡間隔增寬，炎癥細胞滲出，以中性細胞和淋巴細胞為主，肺泡腔狹窄。36、72 h肺組織病理學改變加重，肺泡間隔明顯充血、增寬，大量炎癥細胞滲出，肺泡腔明顯狹窄，有時可見肺實變。見圖1、圖2、圖3。

圖1 SHAM組大鼠肺組織病理學變化(HE×200)

2.3 大鼠肺細胞凋亡CLP組較SHAM組明顯增加，36 h時最明顯。DADLE組較SHAM組明顯增加，但較CLP組明顯降低。DADLE組內仍以36 h時段肺組織細胞凋亡指數最高。見表1。

2.4 肺組織Bcl-2、Caspase-3蛋白表達Bcl-2蛋白的表達率：CLP組各時間點較SHAM組明顯降低，DADLE組較CLP組有明顯增高，較SHAM組表達降低，Bcl-2表達與肺細胞凋亡情況負相關（r=-0.95）。Caspase-3蛋白的表達率：CLP組較SHAM組明顯增高，DADLE組各時間點肺組織較CLP組有明顯降低,較SHAM組增高。Caspase-3表達與肺組織細胞凋亡指數正相關（r=0.71）。見表2。

圖2 CLP組不同時間大鼠肺組織病理學變化。2A：12 h(HE×200)；2B：36 h(HE×200)；2C：72 h(HE×200)

圖3 DADLE組不同時間大鼠肺組織病理學變化。3A：12 h(HE×200)；3B：36 h(HE×200)；3C：72 h(HE×200)

表1 各組大鼠肺細胞凋亡指數變化±s)

表1 各組大鼠肺細胞凋亡指數變化±s)

注：與SHAM組相同時間點比較,*P<0.01;與CLP組相同時間點比較,#P<0.01;與同組12 h比較,ΔP<0.01;與同組36 h比較,▲P<0.01

時間組別SHAM組CLP組DADLE組12 h 0.87±0.52#▲（n=6）36.67±5.68*▲（n=6）28.03±3.49*#▲（n=6）36 h 0.83±0.34#Δ（n=6）44.67±4.01*Δ（n=5）36.50±4.51*#Δ（n=6）72 h 0.67±0.32#Δ▲（n=6）23.02±2.10*Δ▲（n=4）14.30±2.04*#Δ▲（n=5）

表2 各組大鼠肺組織Bcl-2、Caspase-3蛋白表達陽性率±s)

表2 各組大鼠肺組織Bcl-2、Caspase-3蛋白表達陽性率±s)

注：與SHAM組相同時間點比較,*P<0.01;與CLP組相同時間點比較,#P<0.01;與同組12 h比較,ΔP<0.01;與同組36 h比較,▲P<0.01

Caspase-3表達陽性率‰100.36±3.61#102.58±2.36# 99.21±5.27# 805.30±22.32*▲915.36±21.36*▲734.02±24.25*Δ▲588.78±18.36*#▲708.23±25.41*#Δ501.67±31.01*#Δ▲組別n SHAM組CLP組DADLE組12 h 36 h 72 h 12 h 36 h 72 h 12 h 36 h 72 h 6 6 6 6 5 4 6 6 5 Bcl-2表達陽性率‰890.37±45.12#915.56±30.36# 898.01±37.28# 583.32±23.02*▲406.67±24.36*▲635.02±37.23*Δ▲741.67±16.63*#▲646.25±36.32*#▲751.17±54.32*#▲

3 討論

膿毒血癥是引起急性肺損傷最常見的病因。在膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展中，肺臟作為一個重要的靶器官，急性肺損傷可能誘導多器官功能障礙甚至衰竭。細胞凋亡是在一定的生理病理條件下，為維持內環(huán)境或者器官組織構建的需要，由基因控制的細胞自主地有序地死亡。近年來的研究發(fā)現，創(chuàng)傷、感染、損傷后內毒素、炎癥介質、氧自由基等都可誘導肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞的凋亡。膿毒血癥肺組織細胞凋亡參與了肺功能損傷的發(fā)生發(fā)展，凋亡細胞包括肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞、血管內皮細胞和淋巴細胞，細胞凋亡在膿毒血癥是引起急性肺損傷的可能作用為，血管內皮細胞和肺泡上皮細胞的凋亡導致血管壁和肺泡壁通透性增高，滲出增加，引起肺泡彌散功能下降；大量淋巴細胞凋亡導致機體免疫功能紊亂，影響了促炎抗炎反應的平衡，共刺激分子表達能力下降，細胞免疫功能下降。本研究中CLP組大鼠肺組織病理損害明顯，早期肺泡間隔增寬，炎癥細胞滲出，以中性細胞和淋巴細胞為主，肺泡腔狹窄。另外，本研究采用TUNEL法染色，原位檢測細胞凋亡的客觀指標，在制模后12 h肺組織細胞凋亡已顯著高于SHAM組，36 h達到高峰，提示膿毒血癥早期肺組織即可發(fā)生細胞凋亡。

諸多報道認為，肺組織細胞凋亡的發(fā)生與否受Fas/FasL、Bcl-2家族、Caspase家族等因素的調控[4]。Bcl-2蛋白是最重要的抗凋亡物質，在缺血一再灌注條件下，原癌基因Bcl-2激活起到重要內源性抑制凋亡作用。其機理是：⑴抑制凋亡蛋白酶Caspase的激活，阻止凋亡事件的發(fā)生；⑵直接的抗氧化作用；⑶抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質，如細胞色素C；⑷抑制促凋亡蛋白Bax、Bak的細胞毒作用。本研究表明，膿毒血癥時肺組織Bcl-2蛋白的表達明顯降低，但在DADLE處理后，其Bcl-2的表達較CLP組增加，與肺組織細胞凋亡呈負相關。膿毒血癥時具有抗細胞凋亡的Bcl-2蛋白的活性受到抑制，從而誘導肺組織細胞凋亡。

Caspase是一類人冬氨酸特異性的半朧氨酸蛋白酶。已有的研究表明，Caspase-3的激活在肺組織細胞凋亡的發(fā)生中起重要的作用。Caspase-3是細胞凋亡的效應器，是細胞凋亡的下游關鍵酶和調控蛋白，也是Caspase級聯反應中最關鍵的執(zhí)行分子，當Caspase-3被激活，生成活化的Caspase-3 p17和p12亞基，對細胞凋亡的發(fā)生和調制發(fā)揮重要作用。誘導細胞凋亡實質上都是通過Caspase蛋白的次序激活而實現的，大多數觸發(fā)細胞凋亡的因素，最終均需要通過Caspase-3介導的多種信號傳導途徑導致細胞凋亡。因此，Caspase-3是凋亡的最終執(zhí)行者，在凋亡級聯激活中處于核心地位。本研究發(fā)現，膿毒癥后12 h肺組織Caspase-3即有大量表達，DADLE處理后其12 h、36 h及72 h時Caspase-3的表達均可以減少，且發(fā)現Caspase-3的表達與肺細胞凋亡成正相關。

目前，DADLE在移植心保護和休克治療中均取得明顯效果[5]。我們的研究證實，在DADLE處理后，膿毒癥大鼠肺組織損害較對照組減輕，凋亡指數明顯降低，同時證實Bcl-2的表達與肺組織細胞凋亡負相關，Caspase-3表達與肺組織細胞凋亡正相關。因此，我們推斷，DADLE可以通過抑制Caspase-3的激活、同時降低了膿毒癥時對Bcl-2活性的抑制作用，從而抑制肺組織細胞凋亡。

[1]徐笑益，方向明，鮑軍明，等.膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織細胞凋亡的研究[J].全科醫(yī)學臨床與教育，2007，5(1):12.

[2]Park SE,Kim SH,Hossain MA.Korean red ginseng extract induc?es apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells[J].J Ethnophamacol,2008,7(11):3586.

[3]肖旭,梅廣林,胡衛(wèi)東,等.葛根素對大鼠肝缺血再灌注后Cas?pase-3和Bcl-2表達的影響[J].交通醫(yī)學,2008，22(5):472.

[4]雷環(huán)成，王玨，余剛.馬錢子堿中毒大鼠肺組織Bcl-2與Cas?pase-3蛋白的表達[J].鄖陽醫(yī)學院學報，2008，27（5）：426.

[5]Gross GJ.Role of opioids in acute and delayed preconditioning[J]. J Mol Cell Cardiol,2003，35(7):709.

（收稿：2009-12-20修回：2010-06-22）

（責任編輯劉洪斌田在善）

Effect of δ-opioid Receptor Agonists on Apoptosis of Pulmonary Tissue and Expression of Bcl-2 and Caspase-3 in Septic Rat

Yu Huanming,Feng Wenming,Wang Yao.Institute of Molecular Surgery,The First

People’s Hospital of Huzhou City,Zhejiang Province,Hozhou(313000),China.

ObjectiveTo observe the effects ofδ-opioid receptor agonists DADLE on apoptosis of pulmo?nary tissue and expression of Bcl-2 and Caspase-3 in septic rat.MethodsSepsis was reproduced in rats by cecum ligation and puncture(CLP).Fifty-four SD rats were randomly divided into CLP group,DADLE group and sham-operation(SHAM)group.The rats were respectively killed at different time(12 h,36 h and 72 h after operation).Pneumonocyte apoptosis was detected by TdT-mediated dUTP Nick End Labeling(TUNEL).The ex?pressions of Bcl-2 and Caspase-3 protein were detected by immunohistochemistry.ResultsThe pathologic changes in pathological lesin of rats in CLP group were obviously more seriously as compared with SHAM group, while it was improved obviously in DADLE group.The apoptosis index of rat pneumonocytes in CLP group signif?icantly increased as compared with SHAM group(P<0.01),and it was further prominent at 36h(P<0.01). Conclusion The findings indicate that δ-opioid receptor agonists DADLE can obviously improve pulmonary tis?sue pathological changes of septic rats,with the protective mechanism of downregulatiion of Caspase-3 expres?sion and upregulation of Bcl-2 expression,and thus to repress the apoptosis of pulmonary tissue.

δ-opioid receptor agonists,sepsis,apoptosis,Bcl-2,Caspase-3

Q95-33；R631

A

1007-6948(2010)05-0561-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2010.05.015

浙江省湖州市第一人民醫(yī)院普外科，湖州市第一人民醫(yī)院分子外科研究所（湖州313000）

余歡明，E-mail:aquamarine329@163.com