靈芝孢子油檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與其抗腫瘤活性的關(guān)系*

李向敏 ，謝意珍 ，2**，潘鴻輝 ，2，簡(jiǎn)偉明 ，羅 彪 ，李森柱 ，2， 張 智 ，2

（1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

靈芝（Ganoderma lucidum）是中藥寶庫中的珍品[1]。靈芝孢子油是由靈芝孢子粉經(jīng)CO2超臨界萃取而來的靈芝孢子粉中脂溶性物質(zhì)，主要含有三萜類、甾醇類、脂肪及脂肪酸等成分[2，3]。功效研究表明其具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫及增強(qiáng)NK細(xì)胞活性等降血脂[4]、免疫調(diào)節(jié)功能，并具有護(hù)肝[5]及直接抑殺腫瘤干細(xì)胞的作用[4，6]。

由于靈芝孢子油功效顯著，價(jià)格昂貴，所以市場(chǎng)上相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的利益。目前，業(yè)內(nèi)通常采用食用油的質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)即過氧化值、酸價(jià)作為孢子油的主要質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)。由于孢子油所含的活性物質(zhì)如三萜類大部分呈酸性，并含有多種不飽和酸，這些成分都提高了孢子油的酸價(jià)，因此酸價(jià)和過氧化值作為靈芝孢子油的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)能否體現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量就有待進(jìn)一步研究。本研究中采用常規(guī)方法，如KOH標(biāo)準(zhǔn)滴定法測(cè)酸價(jià)、KI-I2法檢測(cè)過氧化值、紫外-可見光分光光度法測(cè)總?cè)疲送饫媚[瘤細(xì)胞檢測(cè)樣品抗腫瘤活性，主要研究靈芝孢子油質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)與其抗腫瘤活性之間的關(guān)系，為靈芝孢子油的質(zhì)量檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)化提供試驗(yàn)依據(jù)和參數(shù)。

1 儀器與試劑

北京普析通用T6新世紀(jì)紫外-可見光光度計(jì)；Agilent LC-1200高效液相色譜儀；NIKON顯微鏡 TS100-F；Galaxy S二氧化碳培養(yǎng)箱等。

靈芝孢子油由廣東省微生物研究所廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供。

齊墩果酸對(duì)照品 （批號(hào) 093K0961，sigma）； 乙腈（HPLC級(jí)，Merck公司產(chǎn)品）；Mill-Q超純水；其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)和結(jié)果

2.1.1 酸價(jià)測(cè)定

參照GB/T 15689-1995。準(zhǔn)確稱取3.00 g～5.00 g混勻的靈芝孢子油，置于錐形瓶中，加入50 mL中性乙醚-乙醇混合液，振搖使油溶解；冷至室溫，加入酚酞指示液2滴，以氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，至出現(xiàn)微紅色，且0.5 min內(nèi)不褪色為終點(diǎn)，并進(jìn)行計(jì)算。

2.1.2 過氧化值測(cè)定

參照GB/T 5009.37-2003。準(zhǔn)確稱取2.50 g混勻的靈芝孢子油，置于250 mL碘瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，振搖使油完全溶解。加入1.00 mL飽和碘化鉀溶液，緊密塞好瓶蓋，并輕輕振搖0.5 min，然后在暗處放置3 min。

取出加100 mL水，搖勻，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.0020 mol·L-1）滴定，至淡黃色時(shí)，加1 mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。

取相同量三氯甲烷-冰乙酸混合液30 mL、碘化鉀溶液1 mL、水100 mL，按上述方法，做試劑空白試驗(yàn)，并計(jì)算結(jié)果。

加入酚酞指示液2滴，以氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，至出現(xiàn)微紅色，且0.5 min內(nèi)不褪色為終點(diǎn)，并進(jìn)行計(jì)算。

2.1.3 三萜含量測(cè)定

參照廣東省地標(biāo)DB44。

（1）樣品處理

取靈芝孢子油0.030 g，準(zhǔn)確至0.1 mg，置于150 mL圓底燒瓶中。加無水乙醇40 mL，70℃水浴加熱，并搖動(dòng)至其完全溶解。冷卻至室溫后用無水乙醇定容至100 mL，待測(cè)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取齊墩果酸儲(chǔ)備液（0.1 mg·mL-1）0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL于 25 mL具塞比色管中，常壓水浴蒸干溶劑。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水水浴調(diào)至室溫。用移液管準(zhǔn)確移取冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑做空白參比，在30 min內(nèi)紫外可見光光度計(jì)在545 nm處測(cè)定吸光光度值y（A）。以吸光度y為縱坐標(biāo)，以三萜含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程為y=0.114X+0.001，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)為0.9988。

（3） 測(cè)定

吸取待測(cè)液1.00 mL于25 mL具塞比色管中，常壓水浴蒸干溶劑。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水水浴調(diào)至室溫。用移液管準(zhǔn)確移取冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑做空白參比，在30 min內(nèi)紫外可見光光度計(jì)在545 nm處測(cè)定吸光光度值y（A）。通過線性回歸方程算得測(cè)定用的樣液中三萜類物質(zhì)的質(zhì)量，并依據(jù)公式計(jì)算結(jié)果。結(jié)果見表1。

（4）精密度試驗(yàn)

取樣品溶液，在波長(zhǎng)545 nm下，連續(xù)測(cè)6次，結(jié)果為吸光度平均值0.560，RSD值為0.00%，表明本方法的精密度良好。

（5）重復(fù)性試驗(yàn)

取2號(hào)樣品，按照（1）和 （3）進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，平行制備6份。利用紫外-可見光分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算出總?cè)频暮?。結(jié)果該樣品的總?cè)破骄繛?2.16%，RSD值為2.3%，表明本方法重復(fù)性良好，

（6）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2號(hào)樣品，按照（1）和 （3）進(jìn)行樣品處理和測(cè)定。利用紫外-可見光分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，在1 h內(nèi)每隔10 min測(cè)定1次，結(jié)果顯示吸光度的平均值為0.5545，RSD值為0.50%，表明樣品制備后在1 h內(nèi)測(cè)定，穩(wěn)定性良好。

（7）回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品4（三萜含量11.20%）0.020 g至容量瓶中，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL起，加入乙酸乙酯溶解，并定容至刻度，搖勻。按測(cè)定方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算，結(jié)果平均回收率95%，表明本方法具有良好的回收率。

2.1.4 樣品的測(cè)定結(jié)果

以上述方法對(duì)3批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 靈芝孢子油各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

樣品1～樣品6的酸價(jià)、過氧化值、總?cè)魄闆r分別如表1所示。

2.2 靈芝孢子油體外抑制腫瘤細(xì)胞的作用和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 樣品的制備

精確稱取樣品于無菌離心管中，用溶劑溶解樣品，配制成濃度為10%（體積比）樣品。充分溶解后，過濾，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中， 然后將樣品稀釋，待用。

2.2.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

MT-1和Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%滅活的胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。將密度為1×105個(gè)·mL-1處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組及不同濃度給藥組，每組設(shè)6個(gè)平行孔，5個(gè)梯度，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度樣品溶液共孵育。分別加入靈芝孢子油溶液1 μL、2 μL、3 μL、 4 μL、 5 μL，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組只加溶劑。 加入藥物后分別培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（P）公式為：

P=n1/n2×100%

式中：n1為實(shí)驗(yàn)組n2為對(duì)照組。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

靈芝孢子油對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用見表2和表3。

表2 靈芝孢子油對(duì)MT-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

表3 靈芝孢子油對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

靈芝孢子油能夠在很低濃度抑制MT-1和Jurkat細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度相關(guān)。

3 小結(jié)和討論

由試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸價(jià)的高低與總?cè)频暮亢涂鼓[瘤作用呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，酸價(jià)越高，總?cè)频暮恳苍礁?，在很低的濃度就能達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)研究是一致的[7-9]。靈芝三萜是靈芝孢子油主要活性成分，已發(fā)現(xiàn)120多種，為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜，含有多種功能基團(tuán)，其中約50%的靈芝三萜類化合物為帶羧基的三萜酸，故靈芝孢子油的本身決定其酸價(jià)較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了靈芝孢子油的酸價(jià)遠(yuǎn)高于國家一級(jí)食用植物油的酸價(jià)指標(biāo)（1.0 mg·g-1），而且酸價(jià)越高，活性越強(qiáng)，故酸價(jià)作為食用油的指標(biāo)引入到靈芝孢子油的品質(zhì)好壞的評(píng)價(jià)是不合理的。

過氧化值同樣作為食用油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)引入到靈芝孢子油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，不同樣品過氧化值的變化不明顯。

本研究旨在通過對(duì)靈芝孢子油已有質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)和活性成分進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)尋找其與抗腫瘤活性作用之間的關(guān)系，為靈芝孢子油的標(biāo)準(zhǔn)化研究提供科學(xué)依據(jù)。綜上所述，酸價(jià)作為食用油的標(biāo)準(zhǔn)引入到靈芝孢子油的質(zhì)量檢測(cè)中，是不能夠體現(xiàn)靈芝孢子油質(zhì)量和活性效果的，總?cè)频暮扛叩驮谝欢ǔ潭壬夏軌蚍磻?yīng)靈芝孢子油質(zhì)量品質(zhì)，為靈芝孢子油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和建立提供有效的試驗(yàn)參數(shù)。

[1]鄧叔群.中國的真菌[M].北京：科學(xué)出版社，1964.

[2]王彬，周科勤，范青生，等.超臨界CO2萃取菌草靈芝孢子油中三萜類物質(zhì)和脂肪酸的測(cè)定[J].食品安全與檢測(cè)，2006，22(1)：74-75.

[3]林志彬，王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理作用[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，38(5)：541-547.

[4]李森柱，謝意珍，周靜文，等.靈芝孢子油主要活性成分及降血脂功能的研究[J].中國食用菌，2006，25(5)：40-42.

[5]黃健康，王鳳巖，黃瓊，等.靈芝孢子油增強(qiáng)小鼠免疫功能及護(hù)肝作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34(7)：1272-1274.

[6]Xie Yi-Zhen,Li Sen-Zhu,Albert Yee,et al.Ganoderma lucidum in hibits tumour cell proliferation and induces tumour cell death[J].Enzyme and Microbial Technology,2006(4):177-185.

[7]陳純 ，王恒邦，吳盈瑩，等.靈芝及靈芝孢子提取物的抗腫瘤及對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶作用的研究[J].中藥藥理與臨床，2008，24(2)：45-49.

[8]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2001.

[9]王江海，袁建平，徐世平，等.薄層色譜-光度法測(cè)定靈芝孢子油中的總?cè)坪縖J].中國食品學(xué)報(bào)，2004，4(3)：76-79.