靈丹菌質(zhì)雙向發(fā)酵工藝及藥效品質(zhì)研究*

許曉燕，鄭林用，李 艷，江 南，余夢(mèng)瑤，羅 霞**

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066；3.成都市經(jīng)濟(jì)信息中心，四川 成都 610041）

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種廣泛應(yīng)用的藥、食兼用真菌，具有促進(jìn)睡眠、緩解機(jī)體疲勞、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗HIV等功效[1]。近年來(lái)，莊毅等提出用現(xiàn)代生物技術(shù)來(lái)改造靈芝等藥用真菌，即 “藥用真菌新型固體發(fā)酵工程”，在發(fā)酵基質(zhì)中增用具有活性成分的各種中藥材作為藥性基質(zhì)，使發(fā)酵的作用不僅是提供營(yíng)養(yǎng)成分，而且因真菌的分解和合成作用產(chǎn)生新的成分，使其性質(zhì)發(fā)生變化，從而使藥用真菌和中藥材原有功效增強(qiáng)，甚至可以產(chǎn)生新的性味、功能，這就具有雙向性，其發(fā)酵產(chǎn)物稱為菌質(zhì)[2]。

丹參，為唇形科鼠尾草屬丹參 （Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜安神、涼血消痛、消腫止痛等功效。在丹參采摘、加工過(guò)程中，除去入藥的部分，會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄?，F(xiàn)代研究表明，邊角料中具有與藥材相似的化學(xué)成分，只是含量較低，將其直接廢棄，不僅對(duì)環(huán)境造成污染，而且浪費(fèi)了大量具有潛在價(jià)值的資源。

本論文采用新型（雙向性）固體發(fā)酵工程技術(shù)，以靈芝為發(fā)酵菌株，在其培養(yǎng)基中增添丹參邊角料，通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化，初步建立靈丹菌質(zhì)的生產(chǎn)工藝，并檢測(cè)靈丹菌質(zhì)的理化指標(biāo)（蛋白質(zhì)、多糖、三萜等），開(kāi)展其活血化瘀的藥效學(xué)研究，旨在為現(xiàn)代菌物藥的研發(fā)提供一種新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

美國(guó)大靈芝（Ganoderma sp.），中國(guó)農(nóng)大生物學(xué)院食用菌研究室提供。

1.1.2 試驗(yàn)藥材

丹參邊角料，購(gòu)自四川省中江縣；丹參藥材，購(gòu)自四川省成都市中藥材市場(chǎng)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（川實(shí)質(zhì)第2002－33號(hào)）。

1.1.4 主要試劑

蒽酮（上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠）；考馬斯亮藍(lán)G-250（上海朗瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司）；丹參酮ⅡA、齊墩果酸（中國(guó)藥品生物制定鑒定所）。

1.1.5 主要儀器

智能光照培養(yǎng)箱，型號(hào)：ZGX-300C，杭州錢(qián)龍儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)，型號(hào)：T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HPLC系統(tǒng)，型號(hào)：Waters 1525，Waters公司；Syncore多樣品定量濃縮儀，瑞士Buchi。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵樣品制備

靈丹菌質(zhì)不同發(fā)酵組合培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。

表1 靈丹菌質(zhì)不同發(fā)酵組合培養(yǎng)基配方比例

按表1配置各組合固體發(fā)酵培養(yǎng)基，控制含水量在60%左右，分裝入袋，115℃滅菌3 h，冷卻后，接入靈芝斜面菌絲（以長(zhǎng)度1.0 cm菌絲體為標(biāo)準(zhǔn)），于恒溫 (27±2)℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 菌絲體日平均生長(zhǎng)速度觀察

從菌絲體萌發(fā)起，記錄發(fā)酵過(guò)程中靈芝菌絲體在各組合培養(yǎng)基質(zhì)上的平均生長(zhǎng)速度。

1.2.3 靈丹菌質(zhì)多糖、蛋白質(zhì)和三萜測(cè)定

多糖含量測(cè)定采用2005版藥典規(guī)定方法[3]硫酸－蒽酮法，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，三萜含量測(cè)定采用草醛冰醋酸－高氯酸顯色法[4]。

1.2.4 靈丹菌質(zhì)丹參酮IIA含量的HPLC分析

HPLC條件為檢測(cè)流動(dòng)相：甲醇∶水=75∶25；檢測(cè)溫度：30℃； 進(jìn)樣量為20 μL； 流速：1 mL·min-1； 檢測(cè)波長(zhǎng) 270 nm。檢測(cè)方法為取菌質(zhì)粉末0.1 g，加入10 mL甲醇，封閉試管口，超聲提取10 min，靜置過(guò)夜，HPLC測(cè)定。

1.2.5 試藥制備

（1）水提：取定量樣品，加10倍蒸餾水，90℃水浴2.5 h，3000 r·min-1離心30 min，取上清；沉淀再加5倍水、3倍水，同法熱提2次；收集3次熱提所得上清液。

（2）醇提：向水提后的樣品中加入2倍體積的95%乙醇，超聲提取 3 h，3000 r·min-1離心30 min，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至結(jié)晶。

（3）將步驟（2）所得結(jié)晶溶于步驟（1）中所得提取液，揮發(fā)至所需濃度即為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)給藥樣品。

1.2.6 對(duì)急性腦缺血缺氧小鼠的保護(hù)作用

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

1.2.7 對(duì)小鼠凝血時(shí)間（CT）的影響

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

1.2.8 對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

1.2.9 對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基組合菌絲體生長(zhǎng)速度的觀察

從靈芝菌絲體萌發(fā)開(kāi)始，以2 d～3 d為1個(gè)時(shí)間單位，記錄菌絲體在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度，得到靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度曲線，如圖1所示。

圖1 靈芝在不同組合中的菌絲體生長(zhǎng)速度

從圖1可以看出，菌絲生長(zhǎng)可分為5個(gè)階段：適應(yīng)生長(zhǎng)期，菌絲生長(zhǎng)較慢，菌絲較纖弱；旺盛期，菌絲活力較強(qiáng)，代謝旺盛，生長(zhǎng)快；下降期，菌絲生長(zhǎng)速度急劇下降；回升期，菌絲生長(zhǎng)速度有所回升；衰退期，菌絲活力衰退，菌絲老齡化，開(kāi)始分泌黃褐色素。結(jié)果表明，菌絲生長(zhǎng)至接種大約15 d后，生長(zhǎng)速度趨于平穩(wěn)且緩慢下降，至30 d后，生長(zhǎng)速度趨于平緩不變。

2.2 不同靈丹菌質(zhì)組合的多糖含量

測(cè)定發(fā)酵40 d后，菌質(zhì)的多糖含量，如圖2所示。

從圖2可以看出，發(fā)酵40 d后，菌質(zhì)組合4的多糖含量最高。

2.3 不同靈丹菌質(zhì)組合的蛋白含量

發(fā)酵40 d后，測(cè)定菌質(zhì)的蛋白質(zhì)含量，測(cè)定結(jié)果如

圖2 各組合靈丹菌質(zhì)多糖含量變化

圖3所示。

圖3 各組合靈丹菌質(zhì)蛋白含量變化

從圖3可以看出，發(fā)酵40 d后，菌質(zhì)組合4的蛋白質(zhì)含量最高。

2.4 不同靈丹菌質(zhì)組合的靈芝酸三萜含量

發(fā)酵40 d后，測(cè)定菌質(zhì)的三萜含量，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 各組合靈丹菌質(zhì)三萜含量

隨著丹參邊角料添加比例的逐漸增大，三萜的含量也基本呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，提示靈丹菌質(zhì)中三萜的含量可能與添加的藥材比例相關(guān)。

2.5 不同靈丹菌質(zhì)丹參酮IIA含量

發(fā)酵40 d后，測(cè)定菌質(zhì)的丹參酮IIA含量，測(cè)定結(jié)果如表圖5所示。

圖5 各組合靈丹菌質(zhì)丹參酮IIA含量

從圖5可以看出，組合3和組合4的丹參酮IIA含量最高且相同。

2.6 對(duì)急性腦缺血缺氧小鼠的保護(hù)作用

從圖2～圖5可以看出，靈丹菌質(zhì)組合4在40 d中止發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物多糖、蛋白質(zhì)、三萜和丹參酮IIA含量較高，因此選取組合4的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行活血化瘀的藥效學(xué)研究。

2.6.1 對(duì)急性不完全腦缺血小鼠的作用

觀察靈丹菌質(zhì)組合4對(duì)小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 對(duì)急性腦缺血缺氧小鼠的保護(hù)作用（x±s，n=10）

相比空白對(duì)照組，丹參藥材組、組合4對(duì)急性不完全腦缺血小鼠的存活時(shí)間均無(wú)明顯的延長(zhǎng)作用，但是組合4具有一定的作用趨勢(shì)。

2.6.2 對(duì)斷頭后小鼠喘息時(shí)間（急性腦缺氧）的影響

觀察靈丹菌質(zhì)組合小鼠斷頭后急性腦缺氧的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，相比空白對(duì)照組，丹參組、組合4對(duì)斷頭后急性腦缺氧小鼠的喘氣時(shí)間均無(wú)延長(zhǎng)作用，但對(duì)小鼠斷頭造成的急性腦缺氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投?，短暫延長(zhǎng)斷頭小鼠喘氣時(shí)間數(shù)秒，仍可視為對(duì)小鼠急性腦缺氧有一定的改善作用，因此，組合4對(duì)小鼠急性腦缺氧有一定的改善作用。

2.7 對(duì)小鼠凝血時(shí)間（CT）的影響

觀察靈丹菌質(zhì)對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 靈丹菌質(zhì)對(duì)小鼠凝血、尾出血時(shí)間的影響（x±s，n=10）

相比空白對(duì)照組，組合4給藥組的小鼠凝血時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組（p<0.05）。

2.8 對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響

觀察靈丹菌質(zhì)組合4對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，相比空白對(duì)照組，組合4給藥組的小鼠尾出血時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組（p<0.05）。

2.9 對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響

觀察靈丹菌質(zhì)對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

注射角叉菜膠24 h后，組合4就表現(xiàn)出明顯的抑制血栓形成作用（p<0.01）；48 h后，丹參藥材組也表現(xiàn)出明顯的抑制血栓形成的作用（p<0.01）；72 h后，2個(gè)給藥組均表現(xiàn)出一定的抑制血栓形成的作用。

表4 靈丹菌質(zhì)組合4對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響（x±s，n=10）

3 討論

在傳統(tǒng)的固體發(fā)酵中，基質(zhì)的作用僅是單向性地為真菌生長(zhǎng)提供所需碳、氮等營(yíng)養(yǎng)，以獲得子實(shí)體為目的，很少注意發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)本身的變化，以及不同基質(zhì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的影響。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究者已開(kāi)始研究在培養(yǎng)基中加入藥用植物，進(jìn)行固體發(fā)酵來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)，如槐芪菌質(zhì)[6]、韓國(guó)藥性米酒[7]。本試驗(yàn)選用中藥材為靈芝的培養(yǎng)基質(zhì)之一，不僅觀察了在培養(yǎng)基質(zhì)中添加不同比例的丹參藥材后，靈芝生長(zhǎng)情況及菌質(zhì)多糖、蛋白質(zhì)、三萜、丹參酮的變化趨勢(shì)，還進(jìn)行了菌質(zhì)提取物活血化瘀的藥效學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，從菌絲體日平均生長(zhǎng)曲線圖可以看出，在組合2、組合3、組合4三個(gè)培養(yǎng)基中，靈芝的生長(zhǎng)速度較快，其中在組合4中，其生長(zhǎng)最快（0.62 cm·d-1）。從多糖、蛋白質(zhì)、三萜、丹參酮的含量來(lái)看，40 d后，組合4的多糖、蛋白質(zhì)、靈芝酸三萜、丹參酮含量較高。綜合前面生長(zhǎng)情況和成分分析的結(jié)果，選取組合4進(jìn)行小鼠活血化瘀的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。藥效試驗(yàn)表明，靈丹菌質(zhì)在腦缺血、缺氧和活血化瘀方面具有比丹參藥材更好的功效；組合4同時(shí)具有延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間、尾出血時(shí)間和抗血栓的作用，表現(xiàn)出良好的活血化瘀功效。

本研究表明，利用有益菌進(jìn)行雙向發(fā)酵能夠有效提高中藥基質(zhì)中的藥用成分，能夠?yàn)榫锼幯邪l(fā)提供一種新材料和新思路，并證實(shí)了新型固體發(fā)酵這種思路的合理性。

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