奧沙利鉑-碘油乳劑制備比例的試驗(yàn)研究

范芳，郝明志，林海瀾#，楊琳，王勁，謝瑞祥(.福建省腫瘤醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室，福州市35004；.福建省腫瘤醫(yī)院介入治療科，福州市35004)

經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)是目前廣泛應(yīng)用于中、晚期肝癌的治療手段，是不能手術(shù)切除肝癌的患者目前的首選治療方法[1]。碘油在肝癌的化療栓塞治療中，除具有一定的栓塞作用外，還可作為化療藥物的載體，使藥物具有一定的緩釋作用，維持化療藥物在病變局部的高濃度，發(fā)揮化療藥物的抗癌作用[2]。在肝癌的化療栓塞治療中，順鉑、阿霉素等化療藥與碘油制成的乳劑已廣泛用于肝癌的介入治療中[3，4]，但到目前為止，肝癌介入栓塞化療仍無標(biāo)準(zhǔn)方案。新藥奧沙利鉑在肝癌的化療中取得了一定療效，但其與碘油混合后的緩釋作用和物理穩(wěn)定性方面的研究則未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究模擬二者臨床實(shí)際應(yīng)用比例及按無菌性要求制備符合肝動(dòng)脈導(dǎo)管注射使用的奧沙利鉑-碘油乳劑(Oxaliplatin-lipiodol emulsion)，以探討其物理化學(xué)穩(wěn)定性，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

GOLD系統(tǒng)高效液相色譜(HPLC)儀，包括125型泵和168型DAD紫外檢測(cè)器(美國(guó)Beckman公司)。

1.2 試藥

超液態(tài)碘油(Ultra-fluide lipiodol，以下簡(jiǎn)稱碘油，法國(guó)Guerbet公司，批號(hào):071U013A，含碘:48%)；注射用奧沙利鉑無菌粉末(批號(hào):09041411，規(guī)格:每支50 mg)、奧沙利鉑對(duì)照品(批號(hào):619090601，純度:99%)均由江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司提供；5%葡萄糖注射液(5%GS，杭州民生藥業(yè)有限公司，批號(hào):10906091，規(guī)格:每袋250 mL)；乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

透析袋(美國(guó)聯(lián)合碳化物公司，允許通過顆粒的分子量為8000～14000)。

2 方法與結(jié)果

2.1 奧沙利鉑濃度的測(cè)定

2.1.1 奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備。精密稱取奧沙利鉑對(duì)照品100.0 mg，用0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖液溶解后定容至100 mL，即得1 mg·mL－1奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

2.1.2 色譜條件[5]。色譜柱為HYPERSIL ODS分析柱及預(yù)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:10%甲醇；流速:1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm；柱溫:室溫；進(jìn)樣量:20 μL。

取“2.1.1”項(xiàng)下奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)貯備液、“2.4”項(xiàng)下空白溶液(5%GS-碘油乳劑(不含奧沙利鉑)＝0.5∶5)及5%GS-碘油(0.5∶5)乳劑透析0.5 h透析液、5%GS-碘油(0.5∶5)乳劑透析24 h透析液進(jìn)樣分析，色譜見圖1。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。準(zhǔn)確吸取適量奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，制成0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg·mL－1的系列濃度的奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)溶液，依“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件操作，對(duì)測(cè)得的奧沙利鉑峰面積(Y)與奧沙利鉑濃度值(X)進(jìn)行回歸得標(biāo)準(zhǔn)方程:Y＝0.131X+0.085(r＝0.9999)，結(jié)果表明奧沙利鉑檢測(cè)濃度線性范圍為0.025～0.500 mg·mL－1。

2.1.4 精密度和回收率試驗(yàn)。在同日內(nèi)測(cè)定5次和連續(xù)5 d每天測(cè)定1次濃度為0.025、0.100、0.400 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算含量，計(jì)算精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD分別為2.27%、1.86%、1.45%；日間RSD分別為1.45%、0.61%、1.87%。

制備奧沙利鉑濃度為0.025、0.100、0.4 mg·mL－1的樣品各6份，測(cè)定后依標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出相應(yīng)的分析濃度，與實(shí)際濃度相比較計(jì)算出相對(duì)回收率。結(jié)果平均相對(duì)回收率為99.90%，RSD＝1.89%。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。將一定濃度的奧沙利鉑溶液置于37℃水浴中，分別于0、2、4、8、12、24 h取樣測(cè)定奧沙利鉑的濃度，結(jié)果RSD＝1.07%，表明奧沙利鉑溶液在測(cè)定條件下穩(wěn)定。

2.2 不同比例奧沙利鉑-碘油乳劑的制備

取50 mg奧沙利鉑分別溶解于0.5、1、2、2.5 mL的5%GS中，再分別與5 mL的碘油混合后置于注射器中，用“單泵法”來回抽20次，停5 min后再抽20次，制成5%GS與碘油比例為0.5∶5、1∶5、2∶5、2.5∶5的乳劑。

2.3 物理穩(wěn)定性的考察[6]

將“2.2”項(xiàng)下制備的乳劑置于400倍普通顯微鏡下觀察乳滴的大小及分布。在顯微鏡下可觀察到，5%GS與碘油的比例為2.5∶5的乳劑乳化不充分，乳滴大小分布不均勻，在油相中可見較多大液滴；2∶5比例的乳劑大液滴數(shù)量明顯降低，但仍可見較大直徑的液滴；1∶5比例的乳劑乳滴大小分布較均勻；0.5∶5比例的乳劑視野中未見較大直徑的液滴，乳滴大小分布更為均勻。乳劑乳滴分布越均勻表明乳化越好，故以0.5∶5比例為最佳。

將“2.2”項(xiàng)下制備的乳劑靜置于試管內(nèi)24 h(試管置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi))，觀察不同時(shí)間奧沙利鉑-碘油乳劑中油水分層情況，結(jié)果見表1。

表1 5%GS與碘油不同比例所制乳劑的分層時(shí)間Tab 1Stratification time of Oxaliplatin-lipiodol emulsion prepared by different proportion of 5%GS to lipiodol

由表1可見，隨著5%GS用量的增加，乳劑的穩(wěn)定性下降。5%GS與碘油的比例為0.5∶5的乳劑最穩(wěn)定，超過24 h未見其分層。

2.4 體外藥物釋放試驗(yàn)[7]

吸取“2.2”項(xiàng)下制備的乳劑2 mL，分別放入透析袋中并置于含100 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L－1，pH＝7.0)的透析液的燒杯中，置于37℃恒溫水浴鍋中透析。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h取樣0.2 mL，每次取樣后均吸取等量的新鮮磷酸鹽緩沖液加入透析液中。分析奧沙利鉑-碘油乳劑(5%GS-碘油＝0.5∶5)透析0.5 h和24 h后透析液中奧沙利鉑的色譜，見圖1c、d)，根據(jù)奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算透析液中奧沙利鉑的濃度，根據(jù)公式計(jì)算出累積釋放度[釋放度＝(奧沙利鉑測(cè)得的累積溶出量/奧沙利鉑總加入量)×100%]。以不同比例的5%GS-碘油乳劑(不含奧沙利鉑)為空白溶液，將50 mg奧沙利鉑溶于5 mL的5%GS中，制成濃度為10 mg·mL－1的奧沙利鉑-5%GS溶液作為無緩釋作用的對(duì)照。

不同比例的奧沙利鉑-碘油乳劑中奧沙利鉑的釋放曲線見圖2。

圖2 不同比例的奧沙利鉑-碘油乳劑的釋放曲線Fig 2Release curves of different proportion of Oxaliplatin-lipiodol emulsion

與奧沙利鉑-5%GS水溶液相比，不同比例的碘油乳化劑均有緩釋作用。5%GS與碘油的比例為2.5∶5、2∶5時(shí)的乳劑釋放快且不穩(wěn)定；相比較前兩者，比例為1∶5的乳劑緩釋作用得以提高；而比例為0.5∶5的乳劑具有優(yōu)良的緩釋作用，奧沙利鉑釋放緩慢且穩(wěn)定。體外釋放試驗(yàn)的結(jié)果與乳滴分布及油水分層現(xiàn)象基本吻合。經(jīng)計(jì)算，釋放到透析液中奧沙利鉑的量和透析袋中經(jīng)透析后的乳劑破乳后測(cè)定的奧沙利鉑的量的總和與加入量大致相當(dāng)；同時(shí)，由圖1d可見，經(jīng)24 h透析后，透析液色譜上仍僅見奧沙利鉑單一的峰，未有其它雜峰，可見，奧沙利鉑在碘油-5%GS乳劑中具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。

3 討論

隨著栓塞劑和栓塞方法的改進(jìn)，TACE已成為非手術(shù)治療肝癌的有效手段。超液態(tài)碘油由于黏度低，容易經(jīng)過較細(xì)的導(dǎo)管注入較細(xì)小的腫瘤血管而作為化療藥物的載體，可與化療藥物制成乳劑或混懸劑，經(jīng)導(dǎo)管注入肝動(dòng)脈，可使化療藥從基質(zhì)中緩慢釋放，從而改變化療藥的釋藥速度，提高化療藥在肝組織中的濃度，延長(zhǎng)化療藥的作用時(shí)間，降低其系統(tǒng)毒性[7]。乳劑的乳滴大小、物理穩(wěn)定性和釋放度是決定栓塞用乳劑或混懸劑療效的的重要因素。

奧沙利鉑為水溶性藥物，不溶于碘油，與碘油形成的乳劑為W/O型，隨著水相的比例增大，形成均勻乳劑越困難。水相與油相的比例降為0.5∶5時(shí)，所用的5%GS既可很好地溶解奧沙利鉑，又易與碘油形成穩(wěn)定的乳劑，甚至不需采用“雙泵法”或超聲乳化，僅需“單泵法”即可，大大簡(jiǎn)便了臨床操作。水相與油相的比例低于0.5∶5時(shí)，由于水相過少未能充分溶解奧沙利鉑反而不易操作。

在體外釋放度試驗(yàn)中，由色譜可見，整個(gè)釋放過程中僅見奧沙利鉑的峰，未見其它雜峰，表明奧沙利鉑-碘油具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，且具有良好的緩釋作用，因而具有臨床適用性，為肝癌的介入治療提供了一種新的栓塞化療選擇方案。

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