豬帶絳蟲腺苷酸激酶的克隆及其重組蛋白免疫反應性的評價

戴佳琳，黃 江*，廖興江，申萍香，周靈貴，劉玉江

(貴陽醫(yī)學院多媒體形態(tài)學實驗室，貴州貴陽550004)

豬帶絳蟲呈世界性分布，人是該寄生蟲唯一的終宿主，成蟲寄生于人的腸道可引起囊尾蚴病(囊蟲病)。因此，對豬帶絳蟲功能基因組學研究，篩選與豬帶絳蟲結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育、物質(zhì)和能量代謝、侵襲和免疫調(diào)節(jié)等密切相關的功能基因，是控制及消滅豬帶絳蟲的前提。本課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建了亞洲帶絳蟲、牛帶絳蟲及豬帶絳蟲成蟲cDNA文庫[1-2]，從該文庫中篩選出腺苷酸激酶(adenylate kinase，ADK)。ADK分布廣泛，是細胞中一種重要的核苷酸激酶，與其他磷酸轉(zhuǎn)移酶對維持細胞中腺苷酸的正常含量及在能量代謝和酶活性調(diào)節(jié)中起著重要的作用。國內(nèi)外對豬帶絳蟲ADK方面的研究尚未見報道，本研究對ADK原核表達和免疫學鑒定，為進一步探討它的酶學特性及豬帶絳蟲能量代謝及非能量代謝方面的研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 亞洲帶絳蟲病人、豬帶絳蟲病人及牛帶絳蟲病人血清取自糞檢陽性的帶絳蟲病人；豬帶絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫構(gòu)建，ADK基因篩選均由本課題組完成[3]。原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)及E.coliBL-21/DE3由中山大學熱帶病防治教育部重點實驗室惠贈。BamHⅠ、XhoⅠ、ExTaq酶、DNA Marker，蛋白分子量標準等試劑購自TaKaRa公司；T4連接酶、IPTG購自Promega公司。

1.2 引物設計及PCR擴增 根據(jù)已獲得的全長ADK基因序列，利用DNAclub軟件設計引物，由上海英駿生物公司合成。P1：5'-ATAGGATCCATG CCCGGGAATTC3'，在5'端引入BamHⅠ酶切位點；P2：5'-CCGCTCGAGTTACTTGATTCCCTTC3'，在 5'端引入XhoⅠ酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導表達和純化 PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切處理，回收、連接后轉(zhuǎn)入E.coliBL-21/DE3感受態(tài)細胞，搖菌培養(yǎng)后依次進行質(zhì)粒提取，雙酶切和PCR鑒定。陽性菌液加入IPTG誘導表達，SDSPAGE電泳檢測[3]，同時設pET-28a(+)質(zhì)粒的誘導前后及重組質(zhì)粒的誘導前作對照。菌體超聲裂解后上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，判斷重組蛋白的可溶性。菌體裂解液經(jīng)Ni螯合物親和層析樹脂(Ni-NTA)層析柱純化，SDS-PAGE分析。

1.4 Western blot分析 將純化的蛋白進行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，分別以亞洲帶絳蟲病人陽性血清、牛帶絳蟲病人陽性血清、豬帶絳蟲病人陽性血清、豬帶絳蟲感染豬陽性血清為一抗進行反應，以正常人血清為一抗作為陰性對照。與辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗人IgG、山羊抗豬IgG室溫孵育，DAB顯色，超純水終止反應。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達質(zhì)粒的鑒定 將重組表達質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定，0.8 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約600 bp有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符，經(jīng)測序表明插入序列與理論序列一致，證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，命名為pET-Ts-ADK(圖1)。

2.2 重組蛋白表達純化結(jié)果 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-Ts-ADK轉(zhuǎn)化到E.coliBL21/DE3中表達，超聲裂解后SDS-PAGE電泳分析表明在約30 ku處出現(xiàn)目的蛋白，通過Ni-NTA層析純化目的蛋白(圖2)。

2.3 Western blot分析 以感染亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲的患者血清及豬帶絳蟲感染豬的陽性血清為一抗，進行western blot，結(jié)果出現(xiàn)較清晰的條帶，而相應位置陰性對照無反應條帶(圖3)。

3 討 論

ADK又稱為肌激酶，它廣泛存在于有機體中，催化腺苷三磷酸(ATP)，使腺苷酸(AMP)磷酸化而生成腺苷二磷酸(ADP)，并通過這個反應來維持腺苷酸組成成分的體內(nèi)平衡，是有機體中一種重要的酶類，在維持能量代謝及酶活性中起著重要的作用[4-10]?；诒菊n題組對3種人體帶絳蟲功能基因組學和蛋白質(zhì)組學的比較研究的基礎和方向，本研究選擇了豬帶絳蟲成蟲ADK作為目標基因，進行克隆表達和免疫學特性的初步研究。

前期試驗通過多個生物信息學分析軟件分析具有ADK的特征性氨基酸序列和保守功能域，篩選出ADK基因[1-2]。本研究在此基礎上成功構(gòu)建了豬帶絳蟲ADK原核表達載體pET-Ts-ADK，并獲得了高效表達，經(jīng)SDS-PAGE試驗分析，結(jié)果表明該蛋白在上清和沉淀中均有表達，并且上清中的含量多于沉淀，由于該酶特別穩(wěn)定，即使在0.1 NHCl中加熱到100℃，或用三氯乙酸處理，也不易失去活性，在本實驗得到ADK有活性的穩(wěn)定的純化蛋白，為以后的酶活性及其他實驗奠定了基礎，相對于以往實驗中其他基因所得到的包涵體蛋白可更為方便的進行深入研究。Western blot結(jié)果表明，純化蛋白能與被感染豬帶絳蟲的病人血清和豬血清、感染的牛帶絳蟲及亞帶絳蟲病人血清反應，表明重組蛋白在純化后具有較好的免疫原性，提示Ts ADK可能是一種潛在診斷抗原。本研究為進一步研究ADK在診斷、藥物及疫苗中的作用提供了實驗依據(jù)。

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