我國A群牛輪狀病毒感染的血清流行病學調(diào)查

李 鑫，常繼濤，劉海軍，于 力

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/大動物傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

A群輪狀病毒(Group A Rotavirus，RV)是多種幼齡動物非細菌性腹瀉的主要病原，屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒屬(Rotavirus)成員。成熟的病毒粒子包含11節(jié)段雙股RNA基因組，可編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和5種非結(jié)構(gòu)蛋白[1-2]。牛輪狀病毒(Bovine Rotavirus，BRV)感染所引起的腹瀉多發(fā)生在1月齡以內(nèi)的犢牛，引起疾病的嚴重程度差別很大，包括無癥狀感染、溫和的自限性腹瀉以及伴有嚴重脫水的重度腹瀉。BRV腹瀉是我國牛消化道傳染病的重要疫病之一，嚴重影響著我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。

有報道顯示BRV在不同的國家和地區(qū)均呈現(xiàn)地方性流行[3-4]。我國對BRV感染及其所致疾病的研究有限，已有的研究表明，BRV在我國的流行也比較廣泛，所引起的危害也很大[5-6]，但是尚無大規(guī)模系統(tǒng)的流行病學調(diào)查研究。為揭示BRV在我國的感染和流行情況，本研究首先建立了BRV抗體的檢測方法，對在2005年～2006年期間采自12省市自治區(qū)的1760份牛血清進行抗BRV抗體檢測，從而獲得A群BRV在我國牛群中的感染和流行情況，為制訂我國BRV感染的防制措施以及BRV疫苗的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 BRV NCDV毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，MA104細胞由本實驗室保存；可拆酶標板購自美國Costar公司；HRP-山羊抗牛IgG抗體購自Sigma；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液購自天根生化科技有限公司。

1.2 血清樣品來源 1760份牛血清于2005年～2006年期間采自我國黑龍江省、云南省、四川省、江蘇省、河北省、山西省、貴州省、山東省、北京市、內(nèi)蒙古自治區(qū)、新疆自治區(qū)和西藏自治區(qū)12個省市自治區(qū)的1歲～8歲成年水牛、黃牛、牦牛及奶牛。用間接免疫熒光法從采自于黑龍江省的牛血清和采自于澳大利亞進口牛的血清中分別篩選出BRV抗體陽性血清和陰性血清。其中105份BRV抗體陰性血清均采自澳大利亞進口牛。

1.3 包被抗原的制備 BRV標準株(NCDV株)經(jīng)50 μg/mL的胰酶 37℃處理1 h后接種于MA-104單層細胞，培養(yǎng)液中含5 μg/mL的胰酶，37℃ 5%CO2培養(yǎng)，90%以上細胞病變(CPE)出現(xiàn)時收毒。反復凍融3次，4000 r/min離心10 min，上清液-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接免疫熒光(IFA) 用NCDV株感染單層MA104細胞，以正常細胞作為陰性對照。用冰凍無水乙醇固定細胞15 min；風干后加入血清，37℃孵育40 min；用PBS洗滌后加入FITC標記的山羊抗牛IgG抗體，37℃孵育40 min；PBS洗滌后于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 間接ELISA 碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋抗原，包被酶標板；37℃封閉1 h；之后加入待檢血清，37℃作用1 h；加入HRP標記的山羊抗牛IgG抗體，37℃作用1 h；TMB顯色液室溫避光作用10 min；2M硫酸溶液終止反應(yīng)，用酶標儀Zenyth 3100測定OD450nm值。

1.6 間接ELISA反應(yīng)的術(shù)式 對ELISA工作條件進行優(yōu)化，包括封閉液和作用時間、待檢血清稀釋倍數(shù)和作用時間、酶標抗體稀釋倍數(shù)和作用時間及顯色液和顯色時間等。判定標準采用臨界值(Cut-Off)法，將間接免疫熒光檢測為BRV抗體陰性的105份澳大利亞進口牛血清進行ELISA測定，計算所有陰性血清ELISA OD450nm值的平均值(X)和標準差(SD)。將X+3SD作為陽性和陰性判定的臨界值[7]。

2 結(jié)果

2.1 A群BRV間接ELISA抗體檢測方法的建立

2.1.1 ELISA反應(yīng)術(shù)式的確立 經(jīng)過對抗原包被濃度和血清稀釋度等條件的優(yōu)化，確定ELISA的最佳工作條件為：抗原最佳包被濃度為25 μg/孔，4℃過夜包被；5%脫脂乳37℃封閉1 h；待檢血清用PBST作1∶100倍稀釋，37℃作用1 h；HRP-山羊抗牛IgG抗體作1∶10000稀釋，每孔100 μL加入酶標板后37℃作用1 h；加入TMB底物室溫避光顯色10 min，每孔加入60 μL終止液終止反應(yīng)，測定OD450nm值。

2.1.2 ELISA判定標準的確定 對105份BRV抗體陰性血清進行ELISA測定，其OD450nm平均值(X)為0.0987，標準差(SD)為0.0107，由此確定該ELISA方法的判定標準為X+3SD，即cut-off值為0.13。如果血清樣品的OD450nm值>0.13為陽性，OD450nm值≤0.13為陰性。對大量被檢血清樣品的評估，確立了弱陽性、中等陽性及強陽性血清的判定標準，0.6≥OD450nm值>0.13的血清作為弱陽性血清；1.0>OD450nm值>0.6的血清作為中等陽性血清；OD450nm值≥1.0的血清作為強陽性血清。

2.1.3 ELISA方法的敏感性試驗 挑選OD450nm值>0.6的血清25份，0.6≥OD450nm值>0.13的血清18份，分別進行間接免疫熒光法檢測。結(jié)果顯示，OD450nm值>0.6的血清免疫熒光檢測出23份陽性，0.6≥OD450nm值>0.13的血清免疫熒光檢測出16份陽性，這兩種方法的總復合率為91%。將陽性血清從100倍起連續(xù)2倍稀釋進行ELISA檢測，結(jié)果顯示，陽性血清稀釋1600倍時OD450nm值仍大于0.13，為陽性結(jié)果，而陰性血清OD450nm值始終低于0.1(圖1)，表明該ELISA方法具有較高的敏感性。

2.2 我國部分地區(qū)BRV感染率的調(diào)查和統(tǒng)計 用間接ELISA方法對采自12個不同地區(qū)的1760份血清樣品進行檢測，BRV抗體陽性血清1744份，總陽性率高達99%(表1)。采自不同地區(qū)的牛血清樣品，抗體陽性率均在97%以上，其中河北、山西、云南、內(nèi)蒙古、西藏、貴州的血清樣品抗體陽性率高達100%；北京的血清樣品最低，抗體陽性率也高達97.2%。這些數(shù)據(jù)表明，BRV在我國大部分地區(qū)呈普遍感染勢態(tài)。

2.3 我國部分地區(qū)牛群中BRV的感染程度和分布特點 根據(jù)所檢測的1760份牛血清抗體ELISA OD450nm值，本研究將OD450nm值劃分為弱陽性抗體水平、中等陽性抗體水平及強陽性抗體水平3個范圍，以便更直觀地反應(yīng)出這些地區(qū)BRV感染程度的不同。圖2結(jié)果顯示，大部分樣品抗體水平屬于中等陽性，其中黑龍江(82.3%)和新疆(80.8%)中等陽性血清比率最高，均超過80%；而中等陽性血清比率最低的為貴州省，其陽性率達50%；強陽性血清比率最高(43.4%)為貴州，其次是內(nèi)蒙古(26.5%)和河北(25%)，較低的是山東(0.5%)和山西(0)。

血清ELISA檢測的OD450nm值越高，表明該地區(qū)在采集血清期間BRV的感染越嚴重。因此，將強陽性血清和中等陽性血清相加并與弱陽性血清、陰性血清的數(shù)量進行比較(圖2)，進而更清晰地反映出各省份近期BRV的感染和流行情況。從圖中可以看出，所檢測地區(qū)牛群的強陽性和中等陽性血清比率均超過了50%，其中黑龍江(90.7%)、內(nèi)蒙古(95.9%)、四川(96.7%)、新疆(95.6%)、貴州(93.4%)均超過90%。最低的江蘇省也達到了55.1%。上述結(jié)果表明，我國牛群中的BRV感染普遍且極為嚴重。

表1 我國部分地區(qū)牛血清BRV抗體的檢測Table 1 Detection of the anti-group A bovine rotavirus antibodies in China

3 討論

本研究對我國BRV感染進行首次大規(guī)模血清流行病學調(diào)查，雖然調(diào)查的范圍并沒有覆蓋我國所有的省區(qū)，但選擇的地域包含了我國的畜牧大省及牛群集中的地區(qū)，具有一定的代表性。由于我國沒有BRV疫苗接種計劃，所以不存在免疫接種來源的抗體，因此高水平抗體的存在可視為正在發(fā)生或曾經(jīng)發(fā)生BRV感染。有文獻報道，母豬感染RV后，哺乳仔豬血清中和母豬初乳中的抗體水平都很高，但在仔豬出生一個月之后其血清抗體則下降到很低的水平[8]。犢牛出生后血清中通過初乳獲得的母源抗體在不經(jīng)歷再次感染的前提下能夠持續(xù)多長時間，目前還沒有詳細的研究。但根據(jù)豬母源抗體資料判斷，犢牛體內(nèi)的母源抗體在出生后的一段時間內(nèi)也會降到相對較低水平。本研究所采集的血清均為1歲～8歲的成年牛，1歲以上的牛如果還能夠檢測到較高水平的BRV抗體，應(yīng)視為經(jīng)歷過BRV的感染。由此推斷，本研究檢測出的抗體尤其是中高水平的抗體是通過自然感染BRV而獲得的，血清抗體的陽性率可以反映出BRV的感染情況。

由于環(huán)境中BRV的普遍存在，牛在生長期內(nèi)會經(jīng)歷多次BRV的感染[9]，所以牛群中血清抗體水平的高低可以反應(yīng)出牛群BRV反復感染的頻率。本研究結(jié)果顯示，所調(diào)查的地區(qū)中大部分地區(qū)的中等陽性和強陽性血清所占比例達80%以上，表明BRV感染呈長期反復流行的狀態(tài)，導致牛群的血清抗體處于較高的水平。

本研究通過對我國部分地區(qū)BRV感染的血清流行病學調(diào)查表明，BRV感染在我國牛群中普遍存在。根據(jù)本調(diào)查結(jié)果結(jié)合BRV的感染特點推斷，我國牛群中不存在抗體陰性牛，只是不同地區(qū)抗體水平有所不同，本調(diào)查中檢出的16頭抗體陰性牛很可能來自澳大利亞進口牛。由于犢牛在出生后7 d內(nèi)最為易感[10]，而調(diào)查結(jié)果顯示，在現(xiàn)地牛群中的BRV抗體水平又高低不同。因此，對我國犢牛BRV感染的免疫預(yù)防可給懷孕母牛在產(chǎn)前一段時間內(nèi)注射疫苗，使母牛群體原本高低不等的血清抗體在產(chǎn)犢前躍升到同一水平，使整個犢牛群體在剛出生后的易感期內(nèi)均能夠獲得足夠的保護性抗體，從而實現(xiàn)對犢牛的有效保護。

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