核運輸因子2在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的時空表達(dá)及其意義*

史 煜，陳春生，曹 亮，陳凌燕，謝 琳，唐仕波△

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院眼科，江蘇 南京 210006;2中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點實驗室，廣東 廣州 510060)

核運輸因子2(nuclear transport factor 2，NTF2)是一種小的二磷酸鳥苷 －Ran(guanosine diphosphate－Ran，GDP－Ran)附著蛋白，通過核膜孔復(fù)合體(nuclear pore complex，NPC)幫助 GDP－Ran進(jìn)入到細(xì)胞核，維持跨膜間GDP－Ran梯度，這個跨膜梯度決定了mRNA、tRNA、轉(zhuǎn)錄因子等大分子轉(zhuǎn)運的方向，對各種生物細(xì)胞的功能起重要的支持作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NTF2基因功能部分性缺失突變會導(dǎo)致果蠅復(fù)眼數(shù)量顯著減少，并且機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)受到很大影響，證實其與眼的發(fā)育和免疫系統(tǒng)有關(guān)[1]，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)NTF2高表達(dá)與糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)呈負(fù)相關(guān)[2]。本研究擬觀察NTF2在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)變化及其分布特點，并探討其與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的變化趨勢，為進(jìn)一步研究NTF2與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 糖尿病大鼠模型的建立

SPF級雄性Wistar大鼠，體重約180－200 g(廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供)，空腹12 h后單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，Sigma)65 mg·kg－1(溶于 10 mmol·L－1檸檬酸緩沖液中，pH4.5)誘導(dǎo)糖尿病模型，注射后72 h用Acute Check羅氏血糖儀(羅氏公司)，取尾靜脈血檢測血糖，血糖濃度大于16.8 mmol·L－1認(rèn)為糖尿病誘導(dǎo)成功。同時取年齡匹配的正常大鼠作為對照組，腹腔注射檸檬酸緩沖液。注射后72 h隨機(jī)分為2周、1月、3月及6月組，每組10只。普通飼料喂養(yǎng)。動物處死前再次測量血糖及體重。

2 伊凡思藍(lán)(Evans blue，EB)灌注視網(wǎng)膜鋪片

取成模后2周、1月及3月糖尿病大鼠和對照組大鼠各4只，按4 mL/kg水合氯醛腹腔注射進(jìn)行深麻醉，EB(Sigma)舌下靜脈注射循環(huán)2 h后，摘除眼球，4%多聚甲醛固定30 min，取視網(wǎng)膜，于視網(wǎng)膜周邊4個象限各剪1小口，將視網(wǎng)膜平鋪于載玻片上，水溶性封片劑封片。用激發(fā)光為546nm波長的濾光片在熒光顯微鏡(Zeiss，Axioplan2 Imaging)下觀察血管分布和形態(tài)并攝片。

3 RT－PCR檢測

收集與糖尿病大鼠不同時點鼠齡匹配的對照組(N2w，N1m，N3m，N6m)，成模 2 周、1 月、3 月及 6 月(D2w，D1m，D3m，D6m)的糖尿病大鼠的眼球各 6 只，分別提取每只大鼠雙眼視網(wǎng)膜總RNA:Trizol reagent(Invitrogen)裂解全視網(wǎng)膜組織，提取總RNA步驟按Trizol說明書進(jìn)行，紫外分光光度儀(Eppendorf)測定RNA純度和含量。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提mRNA完整性。反轉(zhuǎn)錄和cDNA合成采用Fermentas Life Science公司的First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按試劑盒說明操作。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，β －actin:上游引物5'－ ctcgaaccctaaggccaa －3'，下游引物5'－ tcacgcacgatttccctc－3'，產(chǎn)物長度302 bp;NTF2:上游引物5'－ taacgacagaacccaactagg －3'，下游引物5'－gaggaggaaacagcgtgact－3';產(chǎn)物長度353 bp;VEGF－A:上游引物5'－ atcctggagcgttcactg－3'，下游引物5'－ tcaccgccttggcttgtc －3'，產(chǎn)物長度165 bp。PCR擴(kuò)增采用的2×Taq Platinum PCR MasterMix購自北京天為時代生物技術(shù)有限公司。PCR擴(kuò)增(Eppendorf Mastercycler PCR儀)循環(huán)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min，然后94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，時間50 min。凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。使用Gel analyser軟件測定各條帶IA值，以β－actin作為內(nèi)參照，NTF2及VEGF IA值分別與對應(yīng)β－actin IA值相比。以上實驗重復(fù)3次，取各組平均值。

4 視網(wǎng)膜切片NTF2免疫組化

取上述各時點糖尿病組和對照組大鼠，水合氯醛腹腔注射過量麻醉處死，取出眼球，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。新鮮二甲苯脫蠟15 min，2次。通風(fēng)櫥晾干。蒸餾水水化10 min。0.01 mol/L檸檬酸緩沖液浸沒玻片，微波修復(fù)，自然涼至室溫。蒸餾水沖洗1 min×3次，0.1%Triton+TBS浸泡5 min。10%FBS+TBS室溫孵育20－30 min。加1∶1000 NTF2Ⅰ抗(BD)4℃濕盒過夜。Ⅱ抗+Hoechst 33342孵育 37℃ 30 min。TBS 10 min×2次，水溶性封片劑封片觀察。以上實驗重復(fù)3次。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析(ANOVA)的Dunnett’t檢驗比較正常對照組和各糖尿病組之間的差異，各糖尿病組之間的比較采用SNK－q檢驗進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 糖尿病大鼠和對照組鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)

EB注射后視網(wǎng)膜鋪片EB呈紅色熒光，均勻地充盈于血管腔，使視網(wǎng)膜各級血管網(wǎng)絡(luò)包括毛細(xì)血管網(wǎng)能夠清晰地顯示。正常組大鼠可見在低背景熒光下視網(wǎng)膜血管對EB有很好的屏障作用，見圖1A;成模2周后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)未見明顯改變，僅見背景熒光增強(qiáng)，見圖1B;成模1月后血管出現(xiàn)異常節(jié)段性擴(kuò)張，局部血管周圍 EB滲漏，見圖1C。成模3月后可見視網(wǎng)膜毛細(xì)血管EB滲漏增多，背景熒光增強(qiáng)，見圖1D。

Figure1.Flat－mounted，EB －perfused retina from diabitc and normal rats.A:normal retina.Dye was contained in retinal vessels without leakage(×100);B:two weeks after diabetes(D2w)retina，the increasing background fluorescence(×100);C:one month after diabetes(D1m)retina，arrows indicate regional leakages from capillary(×100);D:three months after diabetes(D3m)retina，arrows show the increasing leakages of dye from periphery capillary(×100).圖1 正常和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜EB灌注鋪片熒光顯微鏡照片

2 NTF2和VEGF mRNA在視網(wǎng)膜中的表達(dá)變化

RT－PCR結(jié)果顯示:各組內(nèi)參照β－actin的表達(dá)量較均衡。計算2組各時點NTF2和VEGF與β－actin的比值并進(jìn)行比較。不同鼠齡正常大鼠造模前至6月中各時點NTF2與VEGF的表達(dá)量相似，無明顯改變，P＞0.05，見圖2。故而選用2周正常大鼠視網(wǎng)膜組織為對照組(N)，糖尿病2周、1月、3月和6月視網(wǎng)膜組織為實驗組。糖尿病組大鼠成模2周后(D2w)，VEGF mRNA表達(dá)量開始增加，1月后漸達(dá)高峰，為正常鼠的1.78倍，P＜0.01;3月時VEGF下降，但仍然高于正常，P＜0.01;到糖尿病6月時，VEGF又顯著升高，為正常的1.99倍。正常鼠視網(wǎng)膜NTF2表達(dá)水平相對穩(wěn)定，不隨年齡的增長而變化，病理情況下(糖尿病成模后2周)輕度上升，為正常鼠的1.24倍，P＜0.01，并不隨病程的延長而有明顯變化，P＞0.05。但到糖尿病6個月時，NTF2表達(dá)開始回落，與正常大鼠基本一致，P＞0.05，見圖3。

3 NTF2在糖尿病組和對照組大鼠視網(wǎng)膜切片中的免疫組化結(jié)果

在對照組大鼠的視網(wǎng)膜切片中，可見NTF2陽性染色主要位于節(jié)細(xì)胞的胞漿及內(nèi)核層中，表現(xiàn)為較強(qiáng)紅色熒光，見圖3A。節(jié)細(xì)胞層的小血管壁上也可見陽性染色，見圖3B。糖尿病組中，NTF2表達(dá)及分布與正常組基本一致，無明顯變化，見圖3C。

Figure3.NTF2 and VEGF mRNA expression in diabetic rats.A:RT－PCR analysis.B:RT－PCR quantization showed the expression of NTF2 and VEGF mRNA in normal(N)and diabetic(D)rats.Figure 3B showed an increase in NTF2 level in D2w..n=6.＊＊P＜0.01，##P＜0.01 vs N group.N:control rat retina;D2w:retina from rats of two weeks after diabetes;D1m:retina from rats of one month after diabetes;D3m:retina from rats of three months after diabetes;D6m:retina from rats of six months after diabetes.圖3 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NTF2和VEGF mRNA的表達(dá)

Figure4.Confocal immunohistochemistry image of NTF2 expression.A:normal rat retina stained with anti－NTF2，NTF2 located in inner layers of retina，including NFL and OPL.NTF2 also located in INL except NFL and OSL.B:vessel wall stained with anti－NTF2 antibodies in NFL(red:NTF2;blue:showed the location of INL and ONL)(NFL:nerve fiber layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;ONL:outer nuclear layer).C:NTF2 cells located in dibietic rats retina.NTF2 positive cells showed no difference between normal rats retina and diabetic rats retina.圖4 正常大鼠和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NTF2熒光免疫組化

討 論

1 NTF2與眼及DR的關(guān)系

細(xì)胞核是真核細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器。真核細(xì)胞胞內(nèi)部分被核膜分為核區(qū)與質(zhì)區(qū)，核區(qū)與質(zhì)區(qū)之間存在連續(xù)而有選擇性雙向物質(zhì)交換(核轉(zhuǎn)運)。核膜孔復(fù)合體(nuclear pore complex，NPC)蛋白參與所有大分子物質(zhì)的主動及被動核轉(zhuǎn)運過程。NTF2作為一種重要的NPC相關(guān)蛋白，主要通過NPC幫助GDP－Ran進(jìn)入到細(xì)胞核，維持跨膜間GDP－Ran梯度，這個跨膜梯度決定了mRNA、tRNA、轉(zhuǎn)錄因子等大分子轉(zhuǎn)運的方向，對Ran的功能起重要的支持作用。目前對NTF2的研究局限于其蛋白質(zhì)分子構(gòu)象方面[3]。有關(guān)NPC與人類疾病，如自身免疫性疾病、腫瘤、病毒感染以及遺傳性疾病的關(guān)系日益受到人們的關(guān)注[4]。Bhattacharya 等[1]人發(fā)現(xiàn)，NTF2 表達(dá)下降會導(dǎo)致果蠅復(fù)眼數(shù)目的大量減少，并且果蠅蟲卵的免疫系統(tǒng)遭到嚴(yán)重打擊，這提示NTF2基因在眼部和免疫系統(tǒng)發(fā)育中可能起重要的調(diào)控作用。另外，NTF2在正常大鼠免疫熒光顯示陽性細(xì)胞主要位于節(jié)細(xì)胞及節(jié)細(xì)胞層的血管壁中，Sheffield等[5]在5名老年癡呆癥患者的額葉腦組織活檢的切片免疫組化實驗中發(fā)現(xiàn)NTF2在神經(jīng)元核周圍的異常聚集，提示NTF2在老年癡呆癥發(fā)病中可能起到一定的作用，這更進(jìn)一步表明NTF2與神經(jīng)組織及血管組織關(guān)系的密切性。DR是以微血管病變?yōu)橹鞯难鄄坎l(fā)癥，并伴有后期視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的凋亡，因此，對NTF2基因進(jìn)行深入研究，有望為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機(jī)制和治療提供新的切入點和新的思路。

DR是糖尿病最常見的并發(fā)癥，目前DR遺傳學(xué)研究主要集中于DR易感基因的研究，臨床觀察表明:糖尿病患者并發(fā)DR具有明顯的差異性，有些患者較早發(fā)生DR(易感性)，有些則長期不發(fā)病(非易感性)。針對這一現(xiàn)象，我們根據(jù)Collins提出尋找“genetic factors in maintaining good health”[6]健康基因的新思路，為DR的治療尋找新的靶點，為DR的發(fā)生發(fā)展探索新的研究途徑。選擇20年以上病程的2型糖尿病患者，以是否發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變分為眼底正常組(normal組，N組)和PDR組(P組)，利用基因芯片技術(shù)對比分析2組的基因表達(dá)，并進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析及蛋白功能分析?；蛐酒Y(jié)果發(fā)現(xiàn)NTF2基因在眼底正常組顯著性高表達(dá)[7]，推測這一在眼底正常組高表達(dá)的基因具有保護(hù)糖尿病患者眼底血管功能的作用，所以我們將其作為進(jìn)一步研究的對象。

2 NTF2及VEGF在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)

DR是以新生血管形成為主要標(biāo)志的微血管病變，VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)、特異性最高、最直接的血管新生誘導(dǎo)因子，因此，VEGF在DR的發(fā)生發(fā)展中起很關(guān)鍵的作用[8]，也是DR動物模型觀測的重要指標(biāo)之一。本研究中，我們采用目前最常用的腹腔注射STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病的經(jīng)典DR模型，同時也觀察了VEGF在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的變化。在糖尿病2周后開始升高，到1月時達(dá)到高峰，3月時開始下降，但仍然高于正常，這一結(jié)果與眾多研究一致[9，10]，EB灌注后視網(wǎng)膜鋪片的染料滲漏也證明糖尿病早期即可出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管屏障功能的破壞，進(jìn)一步證實了本研究中STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病的DR模型的成功建立。在此基礎(chǔ)上，我們觀察NTF2在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的動態(tài)表達(dá)，以期初步揭示NTF2與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系。

我們的初步研究結(jié)果顯示:大鼠正常生長過程中，視網(wǎng)膜NTF2在mRNA水平表達(dá)較高且穩(wěn)定，與內(nèi)參照β－actin表達(dá)相當(dāng)，這與其在核轉(zhuǎn)運中的作用密不可分，因而，NTF2是一相對保守的上游基因。在病理狀態(tài)下，糖尿病早期，視網(wǎng)膜中NTF2的改變與VEGF具有同步性，兩者在mRNA水平均在糖尿病成模后2周后均開始升高，此后隨著病程的延長，二者mRNA水平變化各不相同，VEGF表達(dá)到1月時達(dá)到高峰，3月時開始下降，但仍然高于正常，6個月VEGF又開始升高;NTF2在糖尿病2周后，表達(dá)輕度升高，但并未隨病程的延長進(jìn)一步升高，而是表現(xiàn)出在輕度升高后的穩(wěn)態(tài)，這或許是糖尿病初期機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，因NTF2基因相對保守未能出現(xiàn)明顯的增減。隨糖尿病病程延長，6個月時NTF2表達(dá)有所回落，但仍維持較高水平，與VEGF變化呈相反趨勢，提示病變不同時期，二者在糖尿病視網(wǎng)膜病變中所起的作用不同。早期和晚期NTF2的不同表達(dá)模式，很可能是維持代謝紊亂條件下神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及視網(wǎng)膜屏障功能完整的重要適應(yīng)機(jī)制。此實驗中我們還觀察到，在糖尿病1月和3月時，NTF2表達(dá)還較多出現(xiàn)在視網(wǎng)膜內(nèi)核細(xì)胞層，與文獻(xiàn)報道的VEGF蛋白表達(dá)位置一致[10]。由以上結(jié)果我們推論，NTF2很可能在糖尿病視網(wǎng)膜病變中起著一定的調(diào)控作用，其作用途徑及機(jī)理可能與VEGF的作用通路可能有一定的聯(lián)系。當(dāng)然NTF2具體的作用機(jī)制和通路有待進(jìn)一步研究。這也正是本課題組目前正在進(jìn)行的工作。

[1]Bhattacharya AR，Steward R.The Drosophila homolog of NTF－2，the nuclear transport factor－2，is essential for immune response[J].EMBO Rep，2002，3(4):378 －383.

[2]史 煜，李 斌，李 濤，等.rAAV2－NTF2對糖尿病大鼠血視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用[J].中國病理生理雜志，2009，25(4);759－763.

[3]Stewart M.Insights into the molecular mechanism of nuclear trafficking using nuclear transport factor 2(NTF2)[J].Cell Struct Funct，2000，25(4);217 －225.

[4]Cronshaw JM，Matunis MJ.The nuclear pore complex:disease associationsand functionalcorrelations[J].Trends Endocrinol Metab，2004，15(1);34－39.

[5]Sheffield LG，Miskiewicz HB，Tannenbaum LB.Nuclear pore complex proteins in Alzheimer disease[J].J Neuropathol Exp Neurol，2006，65(1);45 －54.

[6]Collins FS，Green ED，Guttmacher AE.A vision for the future of genomics research[J].Nature，2003，422(6934);835－847.

[7]Li B，Zhang HQ，Shi Y，et al.Overexpression of nuclear transport factor 2 may protect against diabetic retinopathy[J].Mol Vis，2009，15(7);861 －869.

[8]周浩川，張惠蓉.增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子含量的檢測[J].中華眼科雜志，1997，33(4);247－250.

[9]Schratzberger P，Walter DH，Rittig K.Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer[J].J Clin Invest，2001，107(9);1083 －1092.

[10]Poulaki V，Joussen AM，Mitsiades N.Insulin－like growth factor－I plays a pathogenetic role in diabetic retinopathy[J].Am J Pathol，2004，165(2);457 －469.