花藥培養(yǎng)與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合快速選育抗條紋葉枯病晚粳稻新品系的技術(shù)探討

于鳳池，姚 堅，姚海根，殷躍軍

(浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016)

水稻條紋葉枯病是由灰飛虱為傳毒媒介的病毒病，近年來，水稻條紋葉枯病在浙江省北部晚粳稻區(qū)呈快速上升趨勢，對水稻安全生產(chǎn)構(gòu)成了很大威脅［1］?；ㄋ幣囵B(yǎng)在水稻育種上的應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代后期，由于它具有縮短育種年限、擴大變異范圍等優(yōu)點，在新品種培育、雜交水稻提純復(fù)壯、新種質(zhì)創(chuàng)制等方面得到了廣泛應(yīng)用［2－3］。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)具有準(zhǔn)確率高、不受生育期限制等優(yōu)點，近年來在水稻育種中的應(yīng)用越來越廣泛，尤其在水稻抗性育種方面應(yīng)用效果頗佳［4］。本研究結(jié)合花藥培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將抗條紋葉枯病主效基因和微效多基因快速聚合到晚粳稻品種中，以提高晚粳稻品種的條紋葉枯病的抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

受體親本:秀水09、秀水128、中間材料秀水132/GP15//丙05111等;抗條紋葉枯病供體親本:鎮(zhèn)稻 631、鎮(zhèn)稻 413、秀水 114和中間材料丙00502/秀水123等。

1.2 條紋葉枯病田間抗性鑒定方法

采用大田自然發(fā)病鑒定。在條紋葉枯病重病區(qū)建立鑒定圃，鑒定圃不防治灰飛虱，于5月中旬播種，單本插，每份材料種植100株左右，8月底調(diào)查株發(fā)病率。

1.3 DNA提取及PCR技術(shù)

用于DNA提取的材料為大田水稻抗條紋葉枯病組合F1植株和花培后代苗期取回的嫩葉片。用于PCR反應(yīng)的引物為 F-5′TAGCCATGCTCATGCGTCAT 3′;R-5′CGCGGTTTGCAGTAGTTGC 3′。引物由上海生物工程有限公司合成。PCR擴增反應(yīng)總體積為 20 μL，其 中 包 括 10 × PCR buffer 2 μL，MgCl22 μL，dNTP 200 μmol·L－1，引物 F，R 各50 ng，基因組 DNA 1μL(約50 ng) 和1 U的 Taq DNA聚合酶。擴增程序如下:下預(yù)變性2 min，94℃下變性45 s，58℃下退火45 s，72℃下延伸1 min，35次循環(huán)，最后72℃下延伸5 min。

1.4 花藥培養(yǎng)技術(shù)

經(jīng)PCR檢測含有抗條紋葉枯病基因的單株，在花藥處于單核靠邊期取樣，采用一步成苗法進行花藥培養(yǎng)。培養(yǎng)基基本成分為:N6大量和 MS微量，添加一定濃度的 NAA、2，4-D、甘氨酸、KT等，以及0.7%瓊脂，5%蔗糖，pH值5.8。花藥經(jīng)過30～40 d的 (26±1)℃暗培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入光照下 (每天12 h)進行分化培養(yǎng)，將分化出的綠苗轉(zhuǎn)移到無激素和低糖濃度的壯苗培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)后，移栽于大田。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

采用以上引物和反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)，并用3%的瓊脂糖凝膠電泳，其中高抗對照品種為丙00-502，中抗品種為 XR278，高感品種為秀水09。根據(jù)電泳條帶判斷樣品的抗感性，并結(jié)合田間抗性鑒定結(jié)果進行最終篩選。2008年秋對29個抗條紋葉枯病組合共計218個花培取樣的F1植株檢測，其中35個植株不含抗條紋葉枯病基因。

2.2 花藥培養(yǎng)

分蘗期于含有抗條紋葉枯病基因的組合F1植株逐株取嫩葉作分子標(biāo)記檢測，淘汰不抗條紋葉枯病組合及植株。于抗條植株花藥處于單核靠邊期時取樣接種。2007年春至2008年春3批接種培養(yǎng)晚粳稻組合共計69個，獲得綠苗10 269株;嘉興正季兩年共獲得花培鑒定株系363份。

3 抗條紋葉枯病晚粳稻新品系的選育

通過對不同組合花藥培養(yǎng)后代材料進行條紋葉枯病分子標(biāo)記檢測、小區(qū)產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀、品質(zhì)及其它抗性鑒定，并在重病區(qū)進行條紋葉枯病自然發(fā)病鑒定。2007、2008年分別篩選到3份對條紋葉枯病抗性較好、其它綜合性狀良好的晚粳稻新品系，其中07HK23、08HK80參加了2008年浙江省晚粳育種攻關(guān)組聯(lián)合品比，07HK75參加了2008年浙江省特早熟晚粳稻區(qū)試，其主要特征如表1所示。

表1 抗條紋葉枯病早熟晚粳稻的主要特征

4 抗條紋葉枯病常規(guī)晚粳稻新品種的高效快速選育程序

基于2年的育種實踐，我們認為花藥培養(yǎng)取樣前，先對取樣植株進行抗條紋葉枯病分子標(biāo)記輔助選擇，可以淘汰不含目標(biāo)基因的組合和植株 (假雜種)，減少花藥培養(yǎng)的工作量，使花培效率大大提高。對花藥培養(yǎng)后代材料苗期進行抗條紋葉枯病分子標(biāo)記檢測可以達到早期選擇的目的，縮小產(chǎn)量鑒定圃的規(guī)模，同時減輕其他鑒定的工作量，提高整個選育工作的效率。因此，我們建立了以下采用花藥培養(yǎng)與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合選育抗條紋葉枯病晚粳稻新品種的程序 (圖1)。

5 小結(jié)與討論

圖1 抗條紋葉枯病晚粳新品種的選育程序

雖然水稻花藥培養(yǎng)已成為水稻育種的成熟手段，但仍存在不少技術(shù)難題與理論問題，其中最主要的問題是花藥培養(yǎng)綠苗率低，白化苗較多，尤其是秈稻的綠苗率只有1.0% ～1.5%［5］;相比之下，粳稻綠苗率較高，一般可比秈稻高5～10倍，但不同親本所配組合間差異很大。在本研究中，2007年上半年28個組合F1花培綠苗率平均為37.13%，變幅在4.84%～79.23%之間 (按管計算);全年2季42個粳稻組合共接種花藥約14 000管，出愈率在75%左右 (按管計算);綠苗率在25%左右(按管計算)。

綠苗率的高低直接影響了花培育種的效率，而影響花藥培養(yǎng)效率的因素是多方面的，既有內(nèi)在因素 (材料的基因型)，也有外在因素 (外植體的發(fā)育程度、取材時期、培養(yǎng)基的組分、培養(yǎng)條件等)［6］。因此，在開展水稻花藥培養(yǎng)育種時，首先需要解決花培的誘導(dǎo)頻率，選擇適宜培養(yǎng)的優(yōu)良組合;探索和研究外植體的合適取材時期;選擇最適的培養(yǎng)基組分，以及最合理的誘導(dǎo)和分化的培養(yǎng)環(huán)境。

分子標(biāo)記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結(jié)合，應(yīng)用于抗條紋葉枯病晚粳稻新品種的選育，提高了育種速度，縮短了育種年限，在本研究中從配組到獲得穩(wěn)定的抗條紋葉枯病新品系只化了2年時間 (每年嘉興、海南2代)，可比常規(guī)育種縮短2年左右。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，新型的分子標(biāo)記不斷涌現(xiàn)，花藥培養(yǎng)力不斷提高，該途徑可望在其他的水稻育種實踐中得到更廣泛的應(yīng)用。

［1］張國鳴，王華弟，戴德江.浙江省水稻條紋葉枯病發(fā)生發(fā)展態(tài)勢與防控對策措施 ［J］.中國植保導(dǎo)刊，2006，26(7):20－21.

［2］倪丕沖.我國水稻花培育種及其應(yīng)用 ［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，1991，(5):5－6.

［3］李梅芳.水稻花培育種前景 ［J］.作物雜志，1991，(3):17－18.

［4］沈圣泉，舒慶堯，吳殿星，等.利用分子標(biāo)記輔助選擇育成抗螟蟲秈稻不育系科龍 A［J］.雜交水稻，2008，23(2):15－18.

［5］柳美南，鐘海明，陳綿橋，等.水稻花藥培養(yǎng)及其應(yīng)用［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，(17):234－236.

［6］王興春，楊長登，李西明，等.分子標(biāo)記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結(jié)合快速聚合水稻白葉枯病抗性基因 ［J］.中國水稻科學(xué)，2004，18(1):7－10.