泡沫分離法提取文冠果果皮皂苷的工藝條件

吳偉杰，李博生

(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

文冠果樹(shù)的適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱、耐瘠薄和耐寒能力強(qiáng)。在內(nèi)蒙古、遼寧、河北、山西、陜西等省均有栽種，是我國(guó)北方重要的木本油料樹(shù)種。文冠果種子含油率高達(dá)35% ～40%［1］，文冠果籽油是優(yōu)質(zhì)的食用油，也可作為生物柴油的原料。生物柴油作為清潔可再生能源，對(duì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，推進(jìn)能源替代，減輕環(huán)境壓力，減少碳排放，應(yīng)對(duì)氣候變暖有著重要的戰(zhàn)略意義。文冠果果實(shí)的綜合利用是降低生物柴油生產(chǎn)成本的重要途徑之一。文冠果包括果皮和種子，兩者比例為1∶1。年產(chǎn)10萬(wàn)t生物柴油，需要文冠果種子30萬(wàn) t，同時(shí)產(chǎn)生30萬(wàn) t果皮，而目前文冠果果皮主要用作活性炭原料，沒(méi)有得到有效地利用。文冠果果皮含有1.5%～2.4%的皂苷。研究表明，文冠果果皮皂苷具有良好的抗腫瘤活性、顯著改善多種記憶障礙、抗缺氧、抗氧化、抗疲勞等功效［2］。文冠果果皮皂苷的開(kāi)發(fā)所產(chǎn)生的附加價(jià)值可以有效地降低生物柴油的生產(chǎn)成本。在生產(chǎn)生物柴油的過(guò)程中要處理極大量的果皮，就須尋求簡(jiǎn)捷易行、高效率、環(huán)境友好的皂苷分離方法。

目前，皂苷的分離方法主要有萃取法和大孔樹(shù)脂吸附分離法。乙醇-正丁醇萃取分離工藝已經(jīng)應(yīng)用于無(wú)患子皂苷的提取分離中［3］，但所需溶劑量大，純度低。采用大孔樹(shù)脂分離法純度較高，但周期長(zhǎng)，溶劑耗量大，樹(shù)脂成本高［4］。

泡沫分離是一種成本低、工藝簡(jiǎn)捷、環(huán)境友好、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的分離方法。皂苷是一種天然的表面活性劑，無(wú)需另加表面活性劑［5］。泡沫分離法已廣泛用于人參皂苷、無(wú)患子皂苷、甘草等的分離，并考察了氣速、pH值、初始濃度、料液溫度等對(duì)泡沫分離的影響［6－8］，而文冠果果皮皂苷泡沫分離純化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我們應(yīng)用泡沫分離法對(duì)文冠果果皮皂苷進(jìn)行分離純化，并對(duì)其工藝條件優(yōu)化及影響因子作了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

文冠果果皮:采于內(nèi)蒙古赤峰，50℃烘干，粉碎機(jī)粉碎。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器:SHB循環(huán)水多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;721紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;DF204電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠;高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;FA10004A電子天平，精天精密儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;6 cm×70 cm樹(shù)脂柱;氣體流量計(jì);氣泵。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 文冠果果皮的總皂苷含量測(cè)定

稱取干燥恒重的人參皂苷Re 4.35 mg，用無(wú)水甲醇定容至10 mL(對(duì)照品)。吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別加入10 mL試管中，水浴揮盡溶劑，加新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70℃水浴加熱15 min，加冰醋酸5.0 mL，搖勻，靜置15 min，立即用分光光度計(jì)于546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［9］，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取干燥恒重的文冠果果皮粉末200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇1 400 mL，70℃冷凝回流5 h。濾去殘?jiān)?，回收乙醇?0%，室溫靜置過(guò)夜，過(guò)濾除去膠質(zhì)，繼續(xù)回收乙醇得浸膏8.365 g。浸膏用8倍水量溶解，3 500 r·min－1離心15 min，上清液用乙酸乙酯 (1∶1，V∶V) 萃取3次，除去雜質(zhì)，水層繼續(xù)用水飽和正丁醇(1∶1，V∶V)萃取3次，合并正丁醇相，濃縮得浸膏［10］。浸膏用60 mL水溶解，經(jīng)濾膜過(guò)濾，吸取0.5 mL加入100 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，制備成待測(cè)液。吸取0.5 mL待測(cè)液于試管中，水浴蒸干溶劑，采用皂苷測(cè)定方法，計(jì)算出文冠果果皮總皂苷的含量。

1.3.2 泡沫分離法純化文冠果果皮皂苷單因素實(shí)驗(yàn)

分別以初始濃度、氣體流速、溫度、pH為單因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各單因素對(duì)泡沫分離法純化文冠果果皮皂苷效果的影響，重復(fù)3次。

1.3.3 優(yōu)化泡沫分離法純化文冠果果皮皂苷的工藝條件正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素水平實(shí)驗(yàn)［11］，篩選確定正交試驗(yàn)各因素1～3水平 A初始濃度 1，2，3 mg·mL－1，B氣體流速 1.5，2.0，2.5 L·min－1，C溫度 20，35，50℃，D pH值3，5，7。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果果皮的總皂苷含量

以人參皂苷為標(biāo)準(zhǔn)樣，按皂苷的測(cè)定方法，y表示吸光度，x表示皂苷的含量，得回歸方程為:y= 2.963 2 x －0.010 3。兩者的相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3?？梢?jiàn)，皂苷含量與溶液吸光度呈密切相關(guān)。據(jù)此測(cè)得文冠果果皮的總皂苷含量為1.973%。該檢測(cè)方法完全可用于研究泡沫分離工藝檢測(cè)皂苷的含量變化。

2.2 初始濃度對(duì)皂苷富集效果的影響

在溫度20℃，氣體流速2.5 L·min－1，pH值5的條件下，考察初始濃度對(duì)皂苷富集效果的影響，結(jié)果 (圖 1)顯示，在初始濃度為 1～2 mg·mL－1時(shí)，隨著初始濃度的增加，富集比升高2.02%，純度升高3.73%;初始濃度在2～5 mg·mL－1時(shí)，隨著濃度的增加，回收率升高14.65%，而富集比和純度分別下降29.7%和10.15%。

圖1 初始濃度對(duì)皂苷富集比、回收率和純度的影響

究其原因，可能初始濃度1～2 mg·mL－1時(shí)，隨著濃度的增加，泡沫穩(wěn)定性增強(qiáng)，夾帶的皂苷量增多，因而提高了富集比;而初始濃度在2～5 mg·mL－1時(shí)，隨著濃度增高，形成大量細(xì)密穩(wěn)定的泡沫，皂苷量和夾帶的液體量增多，夾帶液的增率高于皂苷的增率，富集比下降。初始濃度在1～2 mg·mL－1時(shí)，泡沫夾帶的皂苷量增多，因此純度升高;在2～5 mg·mL－1時(shí)，夾帶的皂苷量和非皂苷類固形物也隨之增多，非皂苷類固形物的增率大于皂苷的增率，純度開(kāi)始降低。隨著濃度的增加，泡沫的穩(wěn)定性增強(qiáng)，夾帶的皂苷量增多，回收率逐漸增大。到達(dá)5 mg·mL－1時(shí)，回收率雖然升高，但此時(shí)富集比和純度下降。由此綜合考慮，初始濃度以2 mg·mL－1左右為宜。

2.3 pH對(duì)皂苷富集效果的影響

在初始濃度為2 mg·mL－1，溫度20℃，氣體流速2.5 L·min－1下，考察初始濃度對(duì)富集效果的影響，結(jié)果 (圖2)表明，pH值在3～5時(shí)，富集比、回收率和純度升高;pH在5～11時(shí)，富集比和純度降低。pH在3～7時(shí)，隨著pH的升高，回收率升高;pH在7～11時(shí)，回收率降低。

圖2 pH值對(duì)皂苷富集比、回收率和純度的影響

分析其原因，pH值在3～5時(shí)，泡沫穩(wěn)定性增加，泡沫夾帶的皂苷量增多，因而提高了富集比;而當(dāng)pH值在5～7時(shí)，形成大量細(xì)密穩(wěn)定的泡沫，皂苷量及夾帶的液體量增多，前者增率小于后者，富集比下降;當(dāng)pH值在7～11時(shí)，泡沫穩(wěn)定性降低，皂苷量及夾帶的液體量均降低，前者降低率大于后者，富集比繼續(xù)下降。pH值在3～5時(shí)，泡沫夾帶的皂苷量增多，純度升高;pH值在5～7時(shí)，皂苷量及夾帶的非皂苷類固形物增多，前者增率小于后者增率，純度降低;pH在值7～11時(shí)，皂苷量及非皂苷類固形物降低，前者降低率大于后者，純度持續(xù)降低。pH值在3～7時(shí)，夾帶的皂苷量增多，回收率逐漸增大;pH值在7～11時(shí)，泡沫夾帶的皂苷量降低，回收率降低。pH值在5～7時(shí)，回收率升高，但富集比和純度下降。綜合考慮，pH值以5左右為宜。

2.4 溫度對(duì)皂苷富集效果的影響

如圖3所示，在初始濃度為2 mg·mL－1，氣體流速為2.5 L·min－1，pH值5下，35℃時(shí)的富集比比20℃時(shí)升高，回收率略有升高，純度降低;從35℃增加到80℃，富集比降低了24.41%，純度降低。20～50℃時(shí)，回收率增加;50～80℃時(shí)，回收率降低。

圖3 溫度對(duì)皂苷富集比、回收率和純度的影響

分析其原因，溫度在20～35℃時(shí)，泡沫起泡性增強(qiáng)，泡沫夾帶的皂苷量增多，因而提高了富集比;35～50℃時(shí)，泡沫粘度增高，皂苷量及夾帶的液體量增多，前者增率小于后者，富集比下降;溫度在50～80℃，泡沫起泡性減弱，皂苷量及夾帶的液體量減少，前者降低率大于后者，富集比持續(xù)降低;20～50℃時(shí)，泡沫中皂苷量及非皂苷類固形物增多，前者增率小于后者，純度降低;溫度在50～80℃時(shí)，皂苷量及非皂苷類固形物降低，前者降低率大于后者，純度持續(xù)降低;溫度在20～50℃時(shí)，泡沫夾帶的皂苷量增多，回收率增大;溫度在50～80℃時(shí)，夾帶的皂苷量減少的，回收率降低;溫度在50℃時(shí)，比35℃的回收率升高;pH值在5～7時(shí)，回收率升高，但富集比和純度均下降。綜合考慮，溫度以35℃左右為宜。

2.5 氣體流速對(duì)皂苷富集效果的影響

在初始濃度為 2 mg·mL－1，溫度20℃，pH值 5的條件下，氣體流速?gòu)?1 L·min－1增至 3 L·min－1，富集比降低了 29.02% (圖 4);從 1 L·min－1增到2 L·min－1時(shí)，純度達(dá)到最高點(diǎn)，氣體流速繼續(xù)增高到 3 mL·min－1時(shí)，純度從64.97%降到60.28%。

圖4 氣體流速對(duì)皂苷富集比、回收率和純度的影響

分析其原因，當(dāng)氣體流速為1～3 L·min－1時(shí)，隨著氣體流速的升高，氣泡在分離設(shè)備中停留時(shí)間短，皂苷量及夾帶的液體量增多，前者增率小于后者，富集比降低;1～2 L·min－1時(shí)，皂苷含量增多，純度增大;在氣體流速為 2～3 L·min－1時(shí)，皂苷量及夾帶的非皂苷類固形物增多，前者增率小于后者，純度降低;氣體流速為1～3 L·min－1時(shí)，皂苷量增多，回收率增大;在氣體流速為3 L·min－1時(shí)，回收率升高;pH值5～7時(shí)，回收率升高，但富集比和純度均下降。綜合考慮，氣體流速以 2 L·min－1為宜。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果 (表1)表明，回收率、富集比及純度都是指標(biāo)越大越好，尤以回收率和純度對(duì)于文冠果果皮皂苷的提純更為重要，因此根據(jù)實(shí)際的生產(chǎn)需要，回收率及純度的權(quán)重各占40%，富集比占20%。其中，富集比=C0/C;回收率= (C0×V0) /(C×V);純度= (C0×V0) /m0;y= ( y1n/y1max×0.4+ y2n/y2max×0.2+ y3n/y3max×0.4) ×100(C0和 C分別指收集液和初始液中文冠果果皮總皂苷的濃度，V0和V分別指收集液和初始液的體積，m0為收集液烘干后所得產(chǎn)品的質(zhì)量，y為綜合得分，y1為回收率，y2為富集比，y3為純度)。

根據(jù)表1的極差分析可知，文冠果果皮總皂苷泡沫分離效果影響因素的主次為:初始濃度>氣體流速>pH>溫度。

表1 泡沫分離條件的篩選結(jié)果

根據(jù)方差結(jié)果，初始濃度和氣體流速因素均為顯著因素;pH和溫度對(duì)分離的影響不顯著。這主要是因?yàn)榱弦旱臐舛葲Q定了溶液中表面活性物質(zhì)的濃度，從而影響了溶液的起泡能力及泡沫的穩(wěn)定性。氣體流速?zèng)Q定泡沫的產(chǎn)生速度以及泡沫的大小，從而影響文冠果果皮總皂苷的富集和純化。而溫度和pH對(duì)溶液的起泡性及泡沫的穩(wěn)定性影響不大。

由表1可以看出，正交實(shí)驗(yàn)得出文冠果果皮總皂苷泡沫分離的最佳工藝條件為A2B3C1D2，即料液初始濃度 2 mg·mL－1，氣體流速 2.5 L·min－1，溫度20℃，pH值5。此時(shí)的富集比為3.05，回收率為60.02%，純度為63.35%。

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得文冠果果皮總皂苷含量為1.973%。不同產(chǎn)地的文冠果果皮皂苷含量變動(dòng)在1.887 0% ～2.007 8%［12］。本實(shí)驗(yàn)得出文冠果皂苷泡沫分離的最佳工藝條件為:料液初始濃度2 mg·mL－1，氣體流速 2.5 L·min－1，溫度20 ℃ ，pH值5。相對(duì)于人參、三七等皂苷泡沫分離時(shí)使用的氣體流速來(lái)說(shuō)，文冠果果皮的氣體流速較低，這樣可以更大限度地減少能耗，降低成本。泡沫分離可在室溫條件下進(jìn)行，避免了加熱所需的能量消耗。經(jīng)測(cè)定，文冠果果皮皂苷的水溶液pH值在5左右，所以進(jìn)行泡沫分離時(shí)無(wú)需調(diào)節(jié)pH值。此時(shí)的富集比為3.05，文冠果皂苷的回收率為60.02%，純度為63.35%。泡沫分離法可以達(dá)到較高的富集比，純度和回收率，本實(shí)驗(yàn)使用的是實(shí)驗(yàn)室自制的起泡裝置。人參、三七等皂苷泡沫分離裝置已經(jīng)相應(yīng)成熟，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，并且可以更好地控制各參數(shù)的變化，如果應(yīng)用到文冠果果皮皂苷的純化，可進(jìn)一步提高皂苷的純度和回收率。

可見(jiàn)，泡沫分離法作為初步分離文冠果皂苷的方法是可行的。皂苷應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛，如醫(yī)藥、食品添加、表面活性劑等，對(duì)皂苷純度的要求差別較大，故通過(guò)氣泡提取得到的皂苷也可能直接應(yīng)用到食品添加或表面活性劑，而醫(yī)藥要求較高的純度，氣泡提取可作為有效的皂苷初提，對(duì)于生物柴油生產(chǎn)，既可節(jié)約提取成本、減少前期投入，又避免了環(huán)境污染，這對(duì)促進(jìn)生物能源樹(shù)種文冠果迅速發(fā)展有重要現(xiàn)實(shí)意義。

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