水通道蛋白4、7、8基因mRNA在新生鼠小腸結(jié)腸炎模型中的表達(dá)

李 松，崔其亮

（1.廣東省東莞市石龍人民醫(yī)院，廣東東莞 523326；2.廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，廣東廣州 510000）

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（neonatal necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒尤其是早產(chǎn)兒胃腸道的一種嚴(yán)重、需要急救治療的疾病，病死率為10%～50%[1]。NEC在發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)胃腸功能紊亂，引發(fā)水電解質(zhì)代謝障礙是該病的重要表現(xiàn)之一。水通道蛋白（AQPs）是一組構(gòu)成水通道與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛存在于動(dòng)物、植物及生物界，它們的發(fā)現(xiàn)起始于Agre-P[2]。在消化道，AQPs在腸上皮細(xì)胞頂端質(zhì)膜表達(dá)對(duì)水通透性起重要作用，并證實(shí)與多種疾病發(fā)病有關(guān)，但NEC發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)的水代謝障礙是否與AQPs表達(dá)變化有關(guān)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本文通過(guò)建立NEC鼠模，用熒光定量技術(shù)揭示NEC發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)的水代謝障礙與AQPs之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

封閉群新生1日齡SD大鼠，雌雄不限，體重8～10 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。與母鼠同籠，母鼠喂養(yǎng)。母鼠自由飲水，喂以條桿狀動(dòng)物飲料，室溫15～25℃，自然采光。

1.2 主要儀器及試劑

Mx-3000P熒光定量?jī)x（美國(guó)Stratagene公司）；自制有機(jī)玻璃常壓低氧艙大小為5 L的廣口瓶，氣孔和出氣孔各1個(gè)；CY-7指針式測(cè)氧儀（成都貝斯達(dá)儀器有限公司）；總RNA提取試劑盒（美國(guó)Promega公司）；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒[Takara寶生物工程（大連）有限公司]；PCR反應(yīng)試劑盒（SYBR GreenⅠ）[Takara寶生物工程（大連）有限公司]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1日齡SD大鼠共20只，體重8～10 g，分為實(shí)驗(yàn)組（n=10）與對(duì)照組（n=10）。實(shí)驗(yàn)組依照“1.3.2”項(xiàng)下方法暴露在低氧條件下，4 d后斷頭處死，對(duì)照組為空氣。

1.3.2 動(dòng)物模型的制作[3]

先給低氧艙通入99.99%CO2，調(diào)節(jié)流速，應(yīng)用CY-7指針式測(cè)氧儀，測(cè)得艙內(nèi)的CO2濃度達(dá)99%后，放入1日齡新生SD大鼠5 min后取出，迅速向艙內(nèi)通入99%O2，應(yīng)用測(cè)氧儀使艙內(nèi)氧濃度達(dá)99%，再將低氧后新生鼠放入艙內(nèi)5 min取出。經(jīng)處理后所有新生鼠均放回母鼠身邊喂養(yǎng)，至第4天斷頭處死，用眼科剪行剖腹術(shù)取出十二指腸下端至直腸上端的腸道組織，-70℃凍存。

1.3.3 染料法（SYBR GreenⅠ法）熒光定量PCR反應(yīng)

1.3.3.1 鼠腸組織總RNA提取 總RNA提取試劑盒由Promega公司提供，按照操作說(shuō)明上的SV Total RNA Isolation System步驟進(jìn)行總RNA提取，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280確定RNA質(zhì)量。28s rRNA條帶強(qiáng)烈且A260/280位于1.8～2.0之間的RNA樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用Takara試劑盒進(jìn)行，取總 RNA 4.0 μl，依次加入 5× Prime ScriptTMBuffer 2 μl，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random primers 0.5 μl， 加無(wú) RNase 水補(bǔ)足配成總體積 10 μl的反應(yīng)液，37℃ 15 min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃ 5 s（逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），合成好的cDNA放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 引物的合成 熒光定量RT-PCR所用的AQP4、7、8和β-actin引物由Takara公司合成，PAGE純化級(jí)別。引物序列如下：β-actin，F(xiàn) 5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3'，R 5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'，第 1026～1175位核苷酸，片段長(zhǎng) 150 bp；AQP4，F(xiàn) 5'-AGC CAC GGG CGT ATT CTG AG-3'，R 5'-CGC CTT GGT TCT GTA GGT TCT GA-3'，第 2615～2731 位核苷酸，片段長(zhǎng) 117 bp；AQP7，F(xiàn) 5'-TTC CTG GCG GAG TTC CTG AG-3'，R 5'-TGC CAC ATG TAT TCC CAT GGT C-3'，第 322～468 位核苷酸，片段長(zhǎng)147 bp；AQP8，F(xiàn) 5'-CGG TCA TCG AGA ACA GTC CAA ATA-3'，R 5'-GCG ACA CAG CAG GGT TGA AG-3'， 第292～417位核苷酸，片段長(zhǎng)126 bp。

1.3.3.4 熒光定量PCR反應(yīng) 以β-actin作為內(nèi)參基因，采用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定內(nèi)參基因用以標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)本。反應(yīng)體系：RT反應(yīng)液2 μl，加 SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μl， 上下游引物各 0.5 μl，加dH2O補(bǔ)足至25 μl總體系。各取樣品3 μl，使用EASY Dilution按 10 倍梯度稀釋 4 次（1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000），每個(gè)濃度各取2 μl，行3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行PCR反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于采用相對(duì)定量法作比較，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)并不要求真實(shí)的起始模板拷貝數(shù)，故制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候需要設(shè)定模板的相對(duì)拷貝數(shù)。上述5個(gè)梯度的樣品對(duì)應(yīng)設(shè)定的相對(duì)拷貝數(shù)分別為5×107copies/μl、5×106copies/μl、5×105copies/μl、5×104copies/μl、5×103copies/μl。 反應(yīng)條件如下：95℃ 10 s 預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)。Mx-3000P熒光PCR儀自動(dòng)讀出待檢樣品Ct值。另外以樣品中起始模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，并以上述配制的按10倍梯度稀釋的樣品為5個(gè)點(diǎn)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動(dòng)計(jì)算出曲線的斜率（slope）及擴(kuò)增效率（E）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

對(duì)照組 AQP4、7、8 基因的平均 Ct值分別為（18.84±0.43）、（19.80±0.43）和（20.68±0.31）。 實(shí)驗(yàn)組 AQP4、7、8 基因的平均Ct值分別為（21.85±0.45）、（22.62±0.24）和（23.51±0.20）。對(duì)照組 β-actin 基因的平均 Ct值為（15.40±0.31），實(shí)驗(yàn)組 β-actin基因的平均 Ct值為（15.30±0.49）。

圖1～4中各條線分別表示 β-actin、AQP4、AQP7和 AQP8標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表相對(duì)模板濃度，縱坐標(biāo)代表Ct值，5個(gè)梯度稀釋點(diǎn)基本在一條直線上，證明Ct值與相對(duì)拷貝數(shù)據(jù)呈良好的線性關(guān)系。熒光定量?jī)x分析軟件求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=aX＋b，X代表起始模板拷貝數(shù)，Y代表Ct值，這樣通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線中方程可求出待檢樣品的相對(duì)拷貝數(shù)。見(jiàn)表1。

圖1 β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 AQP4標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 AQP7標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 AQP8標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 熒光定量RT-PCR測(cè)定各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量（）

表1 熒光定量RT-PCR測(cè)定各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量（）

用Pfaffl[4]推導(dǎo)的數(shù)學(xué)公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量：

Ratio（R）表示目的基因在樣品與對(duì)照品間表達(dá)差異的倍數(shù)，分子部分為目的基因擴(kuò)增效率，分母部分為內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率?！鰿ttarget（control－sample）表示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中目的基因的 Ct值之差，△Ctref（control－sample）表示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中內(nèi)參基因的Ct值之差。Etarget和Ereference分別表示目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。如果目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率都接近100%且相差<5%，也可以將PCR擴(kuò)增效率默認(rèn)為100%，這樣公式就簡(jiǎn)化為2-△△Ct，計(jì)算結(jié)果為R值。R<1表示基因表達(dá)下降，R>1表示基因表達(dá)上升。

采用Pfaffl等[5]設(shè)計(jì)的 REST-2005軟件運(yùn)行 2-△△Ct公式，計(jì)算R值。把所有熒光定量資料包括各實(shí)驗(yàn)組Ct值、對(duì)照組Ct值、模板Ct值和模板濃度倍數(shù)輸入計(jì)算機(jī)，運(yùn)行軟件，軟件自動(dòng)計(jì)算R值及P值。

根據(jù)REST-2005軟件計(jì)算結(jié)果，內(nèi)參β-actin基因的R值為（1.000±1.079）。 AQP4、7、8 基因與內(nèi)參 β-actin 基因比較，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)下降，R 值分別為（0.117±0.129）（P<0.05）、（0.140±0.156）（P<0.05）和（0.134±0.140）（P<0.05）。 實(shí)驗(yàn)組 R<1，與對(duì)照組比較，有顯著性差異（P<0.05）。用REST-2005軟件計(jì)算各基因組QPCR反應(yīng)的反應(yīng)效率（E）、相對(duì)表達(dá)差異倍數(shù)（R）、樣本標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）、95%可信區(qū)間（95%CI）及 P 值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各基因組QRT-PCR反應(yīng)結(jié)果比較

3 討論

目前對(duì)AQPs的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)AQPs參與多種消化道疾病的發(fā)病過(guò)程。主要集中在AQP1～8等幾種。研究發(fā)現(xiàn)，AQPs與口干癥[6]、便秘及大腸內(nèi)液轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[7]。Ma等[8]在AQP5的剔除實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，剔除AQP5基因的大鼠經(jīng)毛果蕓香堿刺激后其唾液分泌量減少60%以上，而剔除AQP1基因及AQP4基因的大鼠唾液分泌量并未見(jiàn)明顯減少，說(shuō)明AQP5在涎腺的分泌中扮演著關(guān)鍵的作用。血管活性腸肽（VIP）神經(jīng)元廣泛分布于回結(jié)腸壁內(nèi)，其遞質(zhì)VIP抑制腸道蠕動(dòng)，參與便秘的發(fā)生。AQPs是VIP作用的最終靶分子之一，VIP能過(guò)cAMP依賴的途徑上調(diào)AQP3及其mRNA的表達(dá)[9]，可以推測(cè)VIP參與便秘發(fā)生與上調(diào)AQPs的表達(dá)，從而促進(jìn)水分的吸收有關(guān)。

小腸大部分切除后出現(xiàn)的腹瀉病，可能與AQPs上調(diào)有關(guān)。Tsujikawa等[10]研究SD大鼠小腸被大部分切除后AQPs mRNA在殘留小腸、回腸、結(jié)腸中表達(dá)的變化，他們選取6周齡SD大鼠（n=15），切除80%遠(yuǎn)端小腸，殘留的小腸、回腸、結(jié)腸分別在術(shù)后第1、3、5、7天切開(kāi)，提取殘留腸黏膜組織，用Northernblot技術(shù)分析AQPs mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殘留小腸AQP1和AQP3 mRNA在術(shù)后1 d表達(dá)明顯增加，AQP7 mRNA在術(shù)后3 d增加，AQP4 mRNA術(shù)后無(wú)變化；結(jié)腸AQP3 mRNA在術(shù)后第1、7天表達(dá)增加，AQP4 mRNA無(wú)改變；AQP8 mRNA表達(dá)在術(shù)后第7天輕微增加，表明小腸大部分切除后除AQP4外，多種AQPs適應(yīng)性上調(diào)。

Hardin等[11]用硫酸鈉葡聚糖（DSS）喂養(yǎng)小鼠制成結(jié)腸炎模型，在進(jìn)食DSS后12 h～7 d，以及從停止進(jìn)食DSS后的恢復(fù)階段第1天至第15天進(jìn)行AQPs作用評(píng)價(jià)，并在實(shí)驗(yàn)階段前3 d對(duì)鼠腸水分吸收進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示，DSS組12～24 h后結(jié)腸AQP4、7、8表達(dá)開(kāi)始減少并持續(xù)至第7天，停止進(jìn)食DDS后逐漸恢復(fù)，且病變腸組織對(duì)水分的吸收減弱。從結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎及感染性結(jié)腸炎患者中提取的病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)相似的改變。

新生兒時(shí)期嚴(yán)重的腸道疾病NEC雖然病因與成人結(jié)腸炎有很大不同，但從病理角度來(lái)看有非常相似的病理改變。各種原因引起的腸壁缺血、低氧被認(rèn)為是發(fā)病的直接因素，特別在新生兒時(shí)期，窒息、低氧、休克等原因引起機(jī)體防御性反射，腸壁血流減少、缺血，腸黏膜屏障損傷情況容易發(fā)生。為了探討AQPs在其中所起到的病理作用，本研究制作鼠模型進(jìn)行前期研究。

NEC鼠模是采用新生SD大鼠，模擬宮內(nèi)低氧環(huán)境下制作而成，用高純度CO2在短時(shí)間內(nèi)使鼠窒息，再通入高純度O2復(fù)蘇，造成腸道微循環(huán)缺血-再灌注損傷的病理過(guò)程。受損的腸組織通過(guò)熒光定量實(shí)驗(yàn)證明，與空白組比較，AQP4、7、8 mRNA在NEC組表達(dá)下降，實(shí)驗(yàn)僅說(shuō)明AQPs在NEC鼠模中的表達(dá)改變，不能直接說(shuō)明這些基因在發(fā)病中的調(diào)節(jié)機(jī)制。Laforenza等[12]認(rèn)為APQs能起到使水跨細(xì)胞吸收或分泌的作用。腸功能出現(xiàn)障礙后，AQPs表達(dá)下降，可能與其蛋白質(zhì)構(gòu)象改變或發(fā)生移位有關(guān)。腸道的消化和吸收功能喪失，腸液大量排出，造成脫水腸液排進(jìn)第三間隙及腹腔，造成體液丟失，引起內(nèi)環(huán)境紊亂，AQPs的表達(dá)變化可能起到維持體液平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。

AQPs與NEC的發(fā)病關(guān)系主要涉及腸腔滲透壓的改變。NEC發(fā)病過(guò)程出現(xiàn)的水代謝障礙可能與AQPs的表達(dá)發(fā)生變化并引起腸腔滲透壓改變有關(guān)。由以上可知，水吸收的主要器官是消化道。AQPs表達(dá)的變化可以影響水的吸收，使機(jī)體出現(xiàn)水代謝障礙，本實(shí)驗(yàn)NEC鼠模從外觀上分析有脫水的表現(xiàn)。NEC鼠模實(shí)驗(yàn)證明AQPs表達(dá)下降，提示發(fā)生NEC病變時(shí)可引起細(xì)胞信號(hào)改變，導(dǎo)致AQPs合成障礙，從而形成NEC發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)因素。目前AQPs在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制下出現(xiàn)的表達(dá)變化，在腎臟、肝臟已有很多學(xué)者闡述清楚，但在消化道方面仍然需要進(jìn)一步研究。

AQPs參與消化道疾病是可能的，但發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜。由于NEC是一種多因素引起的疾病，除AQPs外，還涉及其他如細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮素、血小板活性因子等參與發(fā)病過(guò)程。實(shí)驗(yàn)的最終目的是揭示真相，為臨床打下基礎(chǔ)。希望通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)使相關(guān)工作者對(duì)AQPs給予足夠的重視，認(rèn)識(shí)到AQPs受損是一個(gè)引起機(jī)體水代謝紊亂的危險(xiǎn)因素。

本實(shí)驗(yàn)建立鼠模采用熒光定量方法探討AQPs在消化道中的作用還有許多不完善的地方。首先，NEC是一種多因素引起的疾病，在該鼠模型不能完全反映出來(lái)；其次，對(duì)于AQPs與病因的聯(lián)系仍然認(rèn)識(shí)不夠，不能認(rèn)為AQPs受損直接導(dǎo)致NEC的發(fā)生。目前仍未發(fā)現(xiàn)AQPs與NEC發(fā)病的直接聯(lián)系。目前已有大量的前期工作從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、病理生理、分子生物學(xué)、基因表達(dá)等角度研究AQPs在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)及作用機(jī)制，這些基礎(chǔ)研究最終將應(yīng)用到臨床，為解決疾病與健康問(wèn)題提供理論依據(jù)。

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