恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠免疫功能的影響

孫 艷 ，安熙強(qiáng) ，馬 媛 ，張 濤 ，姚 華 ，賈鴻雁 ，張亞輝

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊 830004；3.新疆柯坪圣泉實(shí)業(yè)有限公司，新疆烏魯木齊 830000）

恰瑪古（蕪菁，Brassica campestris）是一種草本十字花科植物，又稱蔓箐、狗頭芥等?！吨袊胁菟幋笕?、《維吾爾藥志》、《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（維吾爾藥分冊(cè)）》等對(duì)恰瑪古的植物來源、藥材性狀、化學(xué)成分、藥理作用等都有詳細(xì)記載。恰瑪古為一種無毒副作用的植物，具有性溫排毒、提高機(jī)體免疫功能、促進(jìn)消化、清肺、消腫、降血脂、抗癌等藥理作用[1]。恰瑪古蜜膏由恰瑪古和蜂蜜為主要原料制成，本文通過實(shí)驗(yàn)研究對(duì)其在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面的作用進(jìn)行初步探討，為進(jìn)一步開發(fā)其藥用價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄兼用，體重18～22 g，均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)[新醫(yī)動(dòng)字（新）syxk2003-0001]。

1.2 受試樣品與試劑

1.2.1 受試樣品 恰瑪古蜜膏，棕黃色，膏狀，成人每次20～50 g，每天3次，由新疆柯坪圣泉實(shí)業(yè)有限公司研制（批號(hào)20090203）。

1.2.2 試劑 二硝基氯苯（DNCB）（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20070421）；丙酮（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號(hào)20060301）；麻油（新疆馨泉投資有限公司，批號(hào)20080204）；印度墨汁（Solarbio試劑公司）；硫化鋇（西安化學(xué)試劑廠，批號(hào)051022）；碳酸鈉（天津市盛淼精細(xì)化工有限公司，批號(hào)070520）；生理鹽水（新疆制藥廠，批號(hào) 07110721）。

1.2.3 試液配制 4%Giemsa染液（姬姆薩染料1.0 g、甘油66.0 ml、甲醇 66.0 ml）；Alsever溶液（葡萄糖 4.10 g，檸檬酸鈉 1.60 g，氯化鈉0.84 g，蒸餾水200 ml，無菌過濾）；都氏試劑（碳酸氫鈉 0.500 g，氰化鉀 0.025 g，高鐵氰化鉀 0.100 g，蒸餾水500 ml）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SP-752分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；80-2離心機(jī)（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；顯微鏡CH30（日本OLYMPUS產(chǎn)品）；立式壓力蒸氣滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.4 方法

1.4.1 恰瑪古蜜膏對(duì)二硝基氯苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）的影響[2-4]選取昆明種小鼠40只，體重18～22 g，按性別、體重隨機(jī)分為4組，分別為模型對(duì)照組和恰瑪古蜜膏3個(gè)劑量（40、20、10 g/kg）給藥組，各給藥組連續(xù)灌胃給藥 13 d，模型對(duì)照組給等量的蒸餾水（DW）。于給藥后第8天，每組小鼠用8%硫化鋇涂抹于腹部脫毛，范圍約3 cm×3 cm，每組小鼠均用 1%DNCB 丙酮麻油溶液（1∶1）50 μl均勻涂抹于褪毛區(qū)致敏，并于第2天再強(qiáng)化1次。致敏5 d后，將1%DNCB溶液10 μl均勻涂抹于各組小鼠右耳廓兩面進(jìn)行攻擊。攻擊24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳片，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱重，以腫脹度來表示DTH的程度，計(jì)算腫脹抑制率。

腫脹度=右耳重-左耳重。

腫脹抑制率（%）=[（模型組腫脹度－給藥組腫脹度）/模型組腫脹度]×100%。

1.4.2 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳清除能力的影響[5-7]選取昆明種小鼠40只，體重18～22 g，按性別、體重隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組和恰瑪古蜜膏三個(gè)劑量（40、20、10 g/kg）給藥組，各給藥組連續(xù)灌胃給藥10 d，對(duì)照組給等量的蒸餾水。末次給藥1 h后，各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁生理鹽水溶液（1∶4），按每10 g體重注射0.1 ml計(jì)算。各組小鼠分別于注射后 2 min（T1）和 10 min（T2）眼眶取血 20 μl，加入 2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻后于600 nm測(cè)吸光度值A(chǔ)1和A2，將動(dòng)物處死后，取肝、脾稱重，計(jì)算碳廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)α。

1.4.3 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠血清中IgM抗體水平的影響[8-9]選取昆明種小鼠40只，動(dòng)物分組及給藥劑量同“1.4.2”，各給藥組連續(xù)灌胃給藥12 d，對(duì)照組給等量的蒸餾水。各組小鼠均在第4天給藥后2 h腹腔注射SRBC懸液0.2 ml/只。末次給藥1 h后，眼眶取血，離心分離血清，用生理鹽水稀釋200倍后按表1加樣。

表1 測(cè)定樣品吸光度值的加樣Tab.1 The spotting blank of determining the absorbance of sample

各管加樣后于37℃水浴保溫10 min，水浴終止反應(yīng)后離心（2000 r/min，10 min）。取上清液1 ml加都氏試劑3 ml于試管內(nèi)。同時(shí)取SRBC稀釋液0.25 ml、都氏試劑4 ml于另一支試管內(nèi)，充分搖勻，放置10 min，于540 nm處以對(duì)照管作空白，分別測(cè)定各管吸光度值，計(jì)算半數(shù)溶血值HC50和抑制率。

HC50=（樣品吸光度值/SRBC半數(shù)溶血吸光度值）×血清稀釋倍數(shù)。

抑制率（%）=[（對(duì)照組 HC50－給藥組 HC50）/對(duì)照組 HC50]×100%。

1.4.4 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[10-12]選取昆明種小鼠40只，動(dòng)物分組及給藥劑量同“1.4.2”，各給藥組連續(xù)灌胃給藥10 d，對(duì)照組給等量的蒸餾水。于末次給藥1 h后，各組小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞0.4 ml，8 h后處死，剖腹露腹膜，向腹腔內(nèi)注入生理鹽水2 ml，輕揉腹部1 min，吸取腹腔液0.2 ml涂于載玻片上，37℃孵育30 min，取出，以生理鹽水沖洗玻片，吹干，丙酮-甲醇（1∶1）固定 5 min，4%Giemsa染液染色 3～5 min，用蒸餾水漂洗，晾干后，在顯微鏡下觀察200個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞×100%。

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 恰瑪古蜜膏對(duì)二硝基氯苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠耳腫脹度的作用，與對(duì)照組比較，恰瑪古蜜膏40 g/kg和20 g/kg劑量腫脹度顯著高于對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05），說明恰瑪古蜜膏能明顯增強(qiáng)DNCB引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，可激活T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。結(jié)果見表2。

表2 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響（，n=10）Tab.2 Effects of Brassica Campestris Ointment on delayed type hypersensitivity in mice(,n=10)

表2 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響（，n=10）Tab.2 Effects of Brassica Campestris Ointment on delayed type hypersensitivity in mice(,n=10)

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數(shù) 劑量 腫脹度 腫脹抑制率（g/kg） （%）對(duì)照組10-15.4±8.5-恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組101022.7±9.621.45恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組102019.3±7.9*33.22恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組104018.9±7.2**34.60

2.2 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳清除能力的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳清除能力的作用，與對(duì)照組比較，恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量可明顯提高小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α（P＜0.01），20 g/kg劑量可提高小鼠巨噬細(xì)胞廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α（P＜0.05），說明恰瑪古蜜膏能夠提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞的碳清除能力。結(jié)果見表3。

表3 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞碳清除能力的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Brassica Campestris Ointment on the function of phagocytosis in mice(,n=10)

表3 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞碳清除能力的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Brassica Campestris Ointment on the function of phagocytosis in mice(,n=10)

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數(shù) 劑量 碳廓清 吞噬（g/kg） 指數(shù)K指數(shù)α對(duì)照組10-0.017±0.0065.040±0.367恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組10100.019±0.0075.121±0.910恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組10200.022±0.009*5.280±0.752*恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組10400.027±0.004**5.641±0.843**

2.3 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠血清中IgM抗體水平的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠血清中IgM抗體水平的作用，恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；半數(shù)溶血值HC50顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明恰瑪古蜜膏可促進(jìn)小鼠血清中IgM抗體的生成。結(jié)果見表4。

表4 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠血清溶血素含量的影響（，n=10）Tab.4 Effects of Brassica Campestris Ointment on productions of hemolysin in mice(，n=10)

表4 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠血清溶血素含量的影響（，n=10）Tab.4 Effects of Brassica Campestris Ointment on productions of hemolysin in mice(，n=10)

與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 只數(shù) 劑量 半數(shù)溶 抑制率（%）（g/kg） 血值HC50對(duì)照組10-18.6±4.3-恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組101021.7±5.8-16.97恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組102023.6±15.8-26.97恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組104029.9±14.3*-60.50

2.4 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的作用，恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表5 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Brassica Campestris Ointment on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages(,n=10)

表5 恰瑪古蜜膏對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Brassica Campestris Ointment on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages(,n=10)

與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 只數(shù) 劑量 吞噬 吞噬指數(shù)（g/kg） 百分率（%） 對(duì)照組10-16.2±1.70.252±0.046恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組101016.9±2.70.275±0.032恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組102018.7±4.10.313±0.079恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組104018.9±3.4*0.299±0.042*

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，恰瑪古蜜膏能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，明顯增強(qiáng)DNCB引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞清除血液中碳粒的能力，提高小鼠血清中IgM抗體水平。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判定恰瑪古蜜膏具有良好的增強(qiáng)免疫功能的作用，是一種良好的免疫促進(jìn)劑。目前對(duì)恰瑪古在其藥理方面作用的研究甚少，本研究初步顯示了恰瑪古在提高機(jī)體免疫功能方面的藥理作用，為其進(jìn)一步開發(fā)恰瑪古的藥用價(jià)值提供必要的依據(jù)。

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