神經(jīng)節(jié)苷脂對新生鼠缺血再灌注腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

劉 華，付翠捧，孫曉梅，吳玲玲

目前，因圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致的新生兒缺氧缺血性腦損傷是新生兒病死的主要原因之一，新生兒缺血缺氧性腦損傷 （hypoxic ischemic brain damage，HIBD）是圍生期新生兒窒息引起的腦損傷,是常見病、多發(fā)病。嚴(yán)重者可威脅新生兒生命，生存者易留下神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,如腦癱、智力障礙、癲癇、痙攣和共濟(jì)失調(diào)等。必須及早用藥干預(yù)治療。但目前治療效果尚不太滿意。故尋找治療HIBD更為有效的方法有重要意義。有研究顯示外源性單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）可以透過血腦屏障，模擬內(nèi)源性GM1減輕腦缺血再灌注損傷[1，2]。為探討GM1在腦缺氧缺血后神經(jīng)元的保護(hù)作用及在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程中的作用，筆者在新生大鼠腦缺血再灌注模型基礎(chǔ)上，通過給予外源性GM1，分組比較，以病理學(xué)及相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)的測定為依據(jù)以探討GM1在HIBD中的作用與機(jī)制。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 生后6 d Sprague-Dawley（SD）新生大鼠30只（購自東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)部），雌雄不限，體重10～25 g。隨機(jī)分為A組（假手術(shù)對照組）10只，B 組（腦缺血再灌注組）10只，C 組（GM1治療組）10只。其中，B組、C組缺血2 h再灌注46 h，C組于術(shù)前30 min和建模后即刻及24 h以后腹腔注射GM1，每次用量10 mg/kg，術(shù)后48 h取靜脈血后迅速處死各組動(dòng)物。

1.2 動(dòng)物模型的制備[3]采用改良的Longa動(dòng)脈拴線法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。B組和C組于術(shù)后2 h將尼龍線拔除。A組除不插尼龍線外步驟同上。

1.3 電鏡標(biāo)本的制作 A、B、C組各取2只大鼠，迅速處死后，取出距額極5 mm處的梗塞灶邊緣區(qū)腦組織 1 mm×1 mm×1 mm，固定、脫水、包埋、切片、染色后，應(yīng)用JEM-200電鏡觀察、照片。

1.4 測內(nèi)皮素（ET） 用放射免疫方法（試劑盒購自301醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所）。

1.5 血清NO水平測定 用鍍銅鎘還原法。測定外周血中NO2-/NO3-含量，721型分光光度計(jì)（上海第三儀器廠生產(chǎn)），波長545mm處測定各樣本的吸光度值，系列亞硝酸鹽溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 細(xì)胞凋亡染色 采用TUNEL法（TUNEL試劑盒購自北京中山生物制品公司）。

1.7 圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Leuzer-F型圖像分析儀，在400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域面積均為200 μm×200 μm，區(qū)域TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求出±s，均數(shù)間的顯著性分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 切片大體外觀 A組皮質(zhì)、基底節(jié)等區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞無變性、壞死現(xiàn)象，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，偶見凋亡神經(jīng)元細(xì)胞。B組缺血側(cè)皮質(zhì)、基底節(jié)等區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死灶多見，電鏡下部分細(xì)胞溶解、破碎，周邊大量神經(jīng)細(xì)胞體積皺縮，表面迂曲，胞膜內(nèi)陷，染色質(zhì)聚集于核膜下呈小塊狀，可見大小不等的凋亡小體。C組缺血側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)等區(qū)域的神經(jīng)元，無變性、壞死改變，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，膠質(zhì)細(xì)胞足突輕度水腫，電鏡下細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)輕度聚集，核仁清晰可見，線粒體除少許腫脹外，多數(shù)正常。

2.2 ET測定結(jié)果 B、C組血漿ET含量明顯高于A 組（P<0.01），而 C 組明顯低于 B 組（P<0.01），見表1。

2.3 血清NO水平 A組與B組比較差異非常顯著（t=4.094，P<0.01）；A組與C組比較無顯著性差異（t=0.657，P>0.05）；B組與C組比較有非常顯著性差異（t=3.239，P<0.01）。 見表 1。

表1 三組鼠血漿ET及血清NO測定結(jié)果（±s）

表1 三組鼠血漿ET及血清NO測定結(jié)果（±s）

與 A 組比較，△P<0.01；與 B 組比較，※P<0.01

A組 B組 C組ET（ng/L） 31.6±3.06 50.45±5.21△ 41.67±4.20△※NO（mol/L） 44.67±8.6 63.65±9.9△ 47.7±9.8※

2.4 TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù) 凋亡神經(jīng)細(xì)胞核呈棕色，在A組中偶可見凋亡細(xì)胞，B組凋亡細(xì)胞主要位于梗塞邊緣區(qū)的內(nèi)側(cè)，梗塞中心區(qū)域可見散在的凋亡細(xì)胞，C組凋亡細(xì)胞數(shù)量更少，其凋亡細(xì)胞的分布形式與B組相似，見表2。

3 討 論

3.1 GM1的腦保護(hù)作用 本文結(jié)果顯示缺血再灌注組梗塞區(qū)的病理變化明顯重于GM1治療組（P<0.01），GM1治療組鼠腦梗塞區(qū)多數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)不可逆改變，超微結(jié)構(gòu)相對完整，無明顯血管源性及細(xì)胞毒性水腫變化，表明外源性GM1的應(yīng)用可在一定程度上減輕腦神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死的病理過程。細(xì)胞凋亡是嚴(yán)格基因凋控的細(xì)胞程序性死亡，多種因素可誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，筆者通過 TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注后有大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，主要分布于梗塞邊緣區(qū)內(nèi)側(cè)，即缺血半暗帶，這與LIY等的觀察結(jié)果一致。而位于缺血半暗帶的腦神經(jīng)細(xì)胞功能尚處于可逆階段，此時(shí)若給予有效的功能恢復(fù)措施，細(xì)胞功能可復(fù)原如初。本文結(jié)果表明，使用GM1組細(xì)胞凋亡過程受到抑制，說明GM1有保護(hù)腦細(xì)胞作用。

表2 三組新生大鼠TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)（±s）

表2 三組新生大鼠TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)（±s）

與 A 組比較，※P<0.01；與 B 組比較，△P<0.01

計(jì)數(shù)區(qū)域 TUNEL染色體陽性細(xì)胞數(shù)A 組 75 3.4±1.2 B 組 150 115.5±17.2※C 組 150 84.2±11.1※△

3.2 內(nèi)皮素的作用 經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床證實(shí)，在腦缺血或急性腦梗死早期，測定血漿內(nèi)皮素（endothelin，ET）即有明顯升高，ET是一種血管活性肽，其收縮血管作用強(qiáng)于血管緊張素Ⅱ、加壓素及神經(jīng)肽Y，且持久。ET升高可引起缺血區(qū)側(cè)枝血管強(qiáng)烈、持久地收縮，使病灶局部血流進(jìn)一步減少，加重梗塞區(qū)腦組織及神經(jīng)細(xì)胞損傷，形成惡性循環(huán)，影響預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。本文在腦缺血再灌注48 h測得ET明顯升高，但C組的ET升高明顯低于B組，說明ET升高持續(xù)于再灌注后，缺血區(qū)血流再通過后其區(qū)域的微小血管處于高度收縮狀態(tài)，對腦組織損傷作用可能在于再灌注損傷之中，本文結(jié)果證明GM1有明顯降低內(nèi)皮素作用，防止缺血區(qū)血管及微小血管強(qiáng)烈痙攣所造成的腦組織持續(xù)損傷，因而有明顯的腦保護(hù)作用，但GM1降低內(nèi)皮素的作用是直接的還是通過抗自由基而減輕腦組織血管內(nèi)皮損傷實(shí)現(xiàn)的，有待于進(jìn)一步研究。

3.3 GM1對血清NO的影響 本文結(jié)果顯示，缺血再灌注組NO2-/NO3-含量明顯高于假手術(shù)對照組（P<0.01），而GM1治療組其含量明顯低于缺血再灌注組（P<0.01）。NO是一種具有自由基性質(zhì)的氣體生物活性分子，腦缺血缺氧后可出現(xiàn)血清NO暫時(shí)性或一過性升高[2，5]，而延遲性升高多發(fā)生在24 h達(dá)高峰，并維持?jǐn)?shù)天。大量研究表明，NO在腦缺氧缺血性損傷中具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性的雙重作用,生理狀態(tài)下，NOS催化L2Arg和分子氧生成低水平固有型NO，作為內(nèi)皮源性舒張因子具有舒張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、拮抗氧自由基的作用；但HIBD后nNOS及iNOS被激活[6-8]，NO過度合成則可干擾與生物轉(zhuǎn)化有關(guān)的酶類的活性、破壞DNA結(jié)構(gòu)、抑制線粒體的呼吸功能,具有明顯的神經(jīng)毒性作用，與進(jìn)一步導(dǎo)致腦水腫等腦損傷有關(guān)，造成神經(jīng)元的損傷。其功能在腦缺血再灌注組NO2-/NO3-含量明顯高于假手術(shù)對照組也表明此機(jī)制。而且，GMI治療組與其他組比較可推斷GM1通過降低血清NO測定值起到保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的作用[9]。

研究表明GM1通過抑制SD大鼠腦缺血再灌注后ET和NO的生成減輕神經(jīng)元細(xì)胞的變性、壞死，抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，起到腦保護(hù)作用。

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