丙泊酚對(duì)胎兒型和α7煙堿型乙酰膽堿受體的作用*

趙雪蓮 莊心良 安廣權(quán) 高 雁 徐國輝 邢玉英

丙泊酚（Propofol）具有起效快、蘇醒快，且恢復(fù)完善、能抑制嘔吐等多種優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于臨床。丙泊酚因具有較高脂溶性,易通過胎盤屏障。煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）是對(duì)麻醉藥敏感的配體門控型離子通道超家族（LGICS）成員之一。胎兒和新生兒的骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭乙酰膽堿受體主要是胎兒型乙酰膽堿受體（γ-nAChR），其與成人型乙酰膽堿受體（ε-nAChR）有著完全不同的電生理特性。在眾多神經(jīng)煙堿型乙酰膽堿受體（N-nAChR）中，與認(rèn)知、記憶和學(xué)習(xí)功能密切相關(guān)的主要有α7-乙酰膽堿受體（α7-nAChR）亞型。本實(shí)驗(yàn)排除丙泊酚在體內(nèi)分布、代謝和蛋白結(jié)合的影響，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)在人胚腎293細(xì)胞（HEK293）的細(xì)胞膜上分別表達(dá)骨骼肌細(xì)胞神經(jīng)肌肉接頭后膜γ-nAChR和中樞神經(jīng)系統(tǒng)α7-nAChR，從受體水平研究丙泊酚對(duì)γ-nAChR和α7-nAChR這2種受體亞型的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 采用無nAChR表達(dá)的HEK293細(xì)胞（購于上海中科院細(xì)胞所）作為重組nAChR的靶細(xì)胞。在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素及2 mmol/L谷氨酰胺）中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代于35 mm一次性培養(yǎng)皿，密度為1×105，培養(yǎng)24 h。

1.2 亞克隆目的基因 將含小鼠源性α、β、γ、δ和α7基因的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒Psp65α、Psp65β、Psp65δ、Psp64γ 和Psp64α7（美國索克生物研究所贈(zèng)送）通過亞克隆技術(shù)連接到真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1上。并用基因測(cè)序法鑒定連接是否正確。

1.3 HEK293細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及功能鑒定 （1）將含有α、β、δ和γ基因的pcDNA 3.1質(zhì)粒，以2∶1∶1∶1的比例與DMRIE-C Reagent（Invitrogen）脂質(zhì)體混合于1 mL無血清培養(yǎng)基，孵育45 min后，鋪于HEK293細(xì)胞上。（2）含有α7基因的pcDNA3.1質(zhì)粒與DMRIE-C Reagent（Invitrogen）脂質(zhì)體混合于1 mL無血清培養(yǎng)基，孵育45 min后，鋪于HEK293細(xì)胞上。以上2種HEK293細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入含血清的培養(yǎng)基1 mL，再培養(yǎng)24 h后即可應(yīng)用。同時(shí)，用不含目的基因的pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞作為陰性對(duì)照，步驟同上。應(yīng)用全細(xì)胞電壓鉗觀察乙酰膽堿對(duì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的乙酰膽堿受體的作用。不含目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，乙酰膽堿作用不能激發(fā)電流；而含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，乙酰膽堿可激發(fā)電流。

1.4 膜片鉗部分 記錄轉(zhuǎn)錄后細(xì)胞的電流前，先以細(xì)胞外液（NaCl 140 mmol/L;KCl 5.4 mmol/L;CaCl21.8 mmol/L;MgCl21.0 mmol/L;HEPES 10 mmol/L;葡萄糖11.1 mmol/L；阿托品1 μmol/L；以NaOH調(diào)pH至7.4）替換細(xì)胞培養(yǎng)基。用PC-10微電極拉制儀（Narishige公司，日本）分兩步將直徑1.6～2.0 mm玻璃微電極毛胚拉制成微電極，再用MF-830微電極拋光儀拋光。電極內(nèi)液為（CsCl，150 mmol/L；HEPES 10 mmol/L；EGTA 5 mmol/L；Mg-ATP 2 mmol/L；以CsOH調(diào)pH至7.3）。電極電阻為3～5 MΩ。應(yīng)用全細(xì)胞電壓-膜片鉗，記錄電流。電刺激脈沖的給出及電信號(hào)的采入均通過計(jì)算機(jī)程序pClamp 7.0及digidatal 1200轉(zhuǎn)換器接口來完成。采樣頻率1 000 Hz，低通Bessel濾波0.5 kHz。電極阻抗3～5 MΩ，封接阻抗大于1 GΩ時(shí)，吸破細(xì)胞膜成全細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞持續(xù)以細(xì)胞外液1～2 mL/min灌注。

1.5 給藥模式 實(shí)驗(yàn)?zāi)ゃQ制電壓均設(shè)為-80 mV。因HEK293為非興奮性細(xì)胞，從-100 mV～-40 mV的鉗制電壓不影響非去極化肌松藥的效應(yīng)[1-2]。預(yù)先用0.1 μmol/L～3 mmol/L丙泊酚平衡α7-nAChR和γ-nAChR作用的HEK293細(xì)胞30 s，再給予100 μmol/L ACh激動(dòng)受體。給藥前后做單用乙酰膽堿的對(duì)照。持續(xù)給乙酰膽堿4～5 s，記錄峰電流。2次用藥刺激間隔2～3 min，用細(xì)胞外液持續(xù)沖洗，以減少細(xì)胞脫敏感。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 按改良Hill公式計(jì)算得濃度效應(yīng)曲線。采用clampfit 10.0和origin 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

丙泊酚可降低100 μmol/L ACh激發(fā)轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞的γ-nAChR的內(nèi)向電流。但不同濃度丙泊酚對(duì)γ-nAChR內(nèi)向電流抑制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.47，P>0.05）。0.1 μmol/L丙泊酚抑制 γnAChR達(dá)1/3，而3 mmol/L丙泊酚抑制率為37%。丙泊酚可抑制ACh激發(fā)轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞的α7-nAChR的內(nèi)向電流，但不同濃度丙泊酚對(duì)α7-nAChR內(nèi)向電流抑制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.22，P>0.05）。0.1 μmol/L丙泊酚抑制 α7-nAChR為25%與3 mmol/L丙泊酚抑制率相近。相同濃度的丙泊酚對(duì)γ-nAChR的抑制均強(qiáng)于對(duì)α7-nAChR的抑制（P<0.05），見表1、圖1。

表1 不同濃度丙泊酚對(duì)γ-nAChR和α7-nAChR內(nèi)向電流的抑制作用±s）

表1 不同濃度丙泊酚對(duì)γ-nAChR和α7-nAChR內(nèi)向電流的抑制作用±s）

*P＜0．05

組別γ-nAChR組α7-nAChR組t n56 3 mmol/L 0.37±0.10 0.25±0.04 5.46*1 mmol/L 0.39±0.15 0.17±0.04 5.23*100 μmol/L 0.48±0.15 0.21±0.04 6.20*10 μmol/L 0.44±0.11 0.23±0.05 5.55*1 μmol/L 0.47±0.12 0.22±0.05 6.34*0.1 μmol/L 0.34±0.10 0.25±0.03 5.76*F 0.47 0.22組別γ-nAChR組α7-nAChR組t n56

3 討論

丙泊酚作為起效快、作用短暫的靜脈麻醉藥已較多用于臨床產(chǎn)科和小兒的麻醉。但丙泊酚對(duì)新生兒和小兒神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌肌力影響還未確定。Gin[3]采取靜脈推注丙泊酚2.0 mg/kg后再以6 mg/（kg·h）或9 mg/（kg·h）維持，胎兒娩出時(shí)臍動(dòng)、靜脈丙泊酚血藥濃度分別為0.53～1.66 g/L和1.00～2.00 g/L，表明異丙酚能快速通過胎盤。袁愛武等[4]觀察發(fā)現(xiàn)孕產(chǎn)婦應(yīng)用丙泊酚，胎兒娩出30 min新生兒神經(jīng)行為測(cè)定法（NBNA）評(píng)估2例新生兒出現(xiàn)嗜睡,導(dǎo)致行為能力中的2項(xiàng)、主動(dòng)肌張力的3項(xiàng)以及覺醒度為0分。

煙堿型乙酰膽堿受體按不同亞基組成分為肌肉型乙酰膽堿受體和神經(jīng)型乙酰膽堿受體。肌肉型乙酰膽堿受體介導(dǎo)機(jī)體神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)和骨骼肌肌肉收縮。胎兒和新生兒骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭后膜乙酰膽堿受體主要是γ-nAChR。γ-nAChR由5個(gè)亞基組成，即2個(gè)α，1個(gè)β，1個(gè)δ和1個(gè)γ亞基[5]，散布于肌細(xì)胞膜表面，隨著神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育完善，逐漸為 ε-nAChR取代[3，6]。γ-nAChR和 ε-nAChR無論在受體化學(xué)結(jié)構(gòu)還是電生理學(xué)上均有極大差別[7]。本研究結(jié)果表明臨床相關(guān)濃度丙泊酚對(duì)乙酰膽堿激發(fā)的γ-nAChR電流有抑制作用。100 nmol/L丙泊酚能降低乙酰膽堿激發(fā)γ-nAChR的1/3電流幅度。但是100 nmol/L～3 mmol/L的丙泊酚對(duì)γ-nAChR電流抑制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示丙泊酚對(duì)γ-nAChR抑制較弱且為非競(jìng)爭性抑制。從另一方面表明丙泊酚對(duì)胎兒和新生兒骨骼肌肌力有一定的抑制作用。

α7-nAChR屬于神經(jīng)型乙酰膽堿受體，它由5個(gè)α7亞基單獨(dú)組成同型受體。α7-nAChR是腦內(nèi)主要的對(duì)α-金環(huán)蛇毒素（BTX）敏感的神經(jīng)型乙酰膽堿受體。α7-nAChR主要分布于海馬和下丘腦，與人體學(xué)習(xí)，記憶功能有關(guān)，可直接調(diào)節(jié)海馬中間抑制神經(jīng)元突觸傳遞，也可調(diào)節(jié)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、色氨酸、多巴胺和乙酰膽堿的釋放。海馬突觸前和突觸后nAChR能增強(qiáng)全麻藥的抑制作用從而產(chǎn)生健忘[8]。本研究結(jié)果顯示臨床相關(guān)濃度的丙泊酚對(duì)100 μmol/L乙酰膽堿激發(fā)的α7-nAChR電流有輕微的抑制作用，其抑制大小與丙泊酚濃度無關(guān)。3 mmol/L ACh對(duì)α7-nAChR電流的抑制率為1/4。表明α7n-AChR不是丙泊酚主要作用位點(diǎn)。

本研究排除整體研究中肌松藥藥效受個(gè)體差異、藥物分布、結(jié)合和消除等影響，應(yīng)用了2類重組受體，這樣可排除其他因素影響，從乙酰膽堿受體水平研究丙泊酚的作用，結(jié)果證明丙泊酚對(duì)γnAChR和α7-nAChR都有抑制作用，抑制程度與丙泊酚的濃度無關(guān)。

[1]Pollard BJ,Jones RM.Interactions between tubocurarine,pancuronium and alcuronium demonstrated in the rat phrenic nervehemidiaphragm preparation[J].Br J Anaesth,1983，55(11):1127-1131.

[2]安廣權(quán),趙雪蓮,高英超,等.羅庫溴銨復(fù)合維庫溴銨或阿曲庫銨對(duì)骨骼肌成人型和胎兒型乙酰膽堿受體的作用[J].天津醫(yī)藥，2008，32（3）：204-207.

[3]Gin T.Propofol during pregnancy[J].Acta Anaesthesiol Sin，1994，32(2):127-132.

[4]袁愛武，陳靜，李雪梅，等.異丙酚用于剖宮產(chǎn)的胎盤轉(zhuǎn)移和對(duì)新生兒的影響[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（18）：1-3.

[5]Kim KS,Chun YS,Chon SU,et al.Neuromuscular interaction betweencisatracurium and mivacurium,atracurium,vevuronium or rovuronium administered in combination[J].Anaesthesia,1998，53(9):872-878.

[6]Naguib M,Samarkandi AH,Bakhamees HS,et al.Comparative potency of steroidal neuromuscular blocking drugs and isobolographic analysis of the interaction between rocuronium and other aminosteroids[J].Br J Anaesth,1995，75(1):37-42.

[7]Jahn K,Mohammadi B,Kramplf K,et al.Deactivation and desensitization of mouse embryonic-and adult-type nicotinic receptor channel currents[J].Neuroscience Letters,2001，307(2):89-92.

[8]Coates KM,Mather LE,Johnson R,et al.Thiopental is a competitive inhibitor at the Human α7 nicotinic acetylcholine receptor[J].Anesth Analg,2001，92(4):930-933.