低氧刺激對GES-1細(xì)胞MICA基因和蛋白表達(dá)的影響*

張曉巖 張先鈞 王海燕 蒲小燕 賈 煒 王晉青

MHCⅠ類鏈相關(guān)蛋白A（major histocompatibility complex classⅠchain related protein A，MICA）是由位于人類第6號染色體短臂6p21．31的人類白細(xì)胞抗原（HLA）復(fù)合體中的MICA基因編碼的非經(jīng)典HLAⅠ類分子。MICA通過與C型凝集素樣活化性受體NKG2D的結(jié)合,影響多種免疫效應(yīng)細(xì)胞功能表現(xiàn)。MICA被認(rèn)為人類“誘生性”細(xì)胞表面抗原,在組織細(xì)胞受到過度應(yīng)激(如熱休克等)的情況下則會誘生表達(dá)或上調(diào)表達(dá)[1]，而正常情況下在上皮細(xì)胞、角朊細(xì)胞等表面可檢測到表達(dá)[2]。高原環(huán)境下缺氧是重要的應(yīng)激因素[3]，也是導(dǎo)致一些高原地區(qū)某些疾病高發(fā)的可能原因。本研究通過觀察體外培養(yǎng)人胃上皮細(xì)胞株GES-1的低氧刺激MICA基因的表達(dá)，探討低氧對其表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 人胃上皮細(xì)胞株GES－1購自北京市腫瘤研究所，山羊抗人MICA單克隆抗體（購自R＆D公司），生物素－鏈霉素抗生物素蛋白檢測系統(tǒng)（SP）試劑盒購自北京中杉公司，Trizol試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Promega公司，高糖DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清購于Gibco公司。MICA引物：上游5′－GAGCCCCACAGTCTTCGTTAT－3′，下游5′－CCTGAC GTTCATGGCCAA－3′（429 bp）；β－actin引物：上游5′－TGAC GGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA－3′，下游5′－CTAGA AGCATTTGCGGACGATGGAGGG－3′（661 bp），均由上海生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理GES-1細(xì)胞常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,加青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L。培養(yǎng)細(xì)胞于生長的對數(shù)期，將細(xì)胞（5×105/mL）置于Jouan三氣培養(yǎng)箱內(nèi),設(shè)置缺氧條件:37℃,5%CO2，5%O2，90%N2，分別于培養(yǎng)0、12、24和72 h時檢測MICA mRNA和蛋白的表達(dá)。

1．3 MICA mRNA檢測 嚴(yán)格按試劑盒說明書提取胃上皮細(xì)胞總RNA?？俁NA提取后用紫外光分光光度計測量吸光度值A(chǔ)260、A280，并控制樣本的A260/A280比值在1.7～2.0之間。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，MICA mRNA的PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，退火溫度為55℃60 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃10 min后終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于15 g/L的瓊脂糖凝膠做電泳,以無菌水代替cDNA模板的PCR管為陰性對照，凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶拍照并進行半定量分析。MICA mRNA相對表達(dá)量以同一反應(yīng)體系中目的產(chǎn)物電泳條帶密度指數(shù)與內(nèi)參對照β-actin電泳條帶密度指數(shù)的比值來表示。

1.4 細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)染色 細(xì)胞爬片后用4%多聚甲醛4℃固定30 min；PBS洗5 min，共3次；正常山羊血清37℃孵育10 min，濾紙吸干；一抗（兔抗人MICA單克隆抗體）稀釋濃度5 mg/L；4℃過夜；PBS洗5 min共3次；滴加生物素化兔抗山羊IgG 37℃30 min，加試劑SP，室溫孵育后DAB顯色，蘇木素復(fù)染、封片。染色結(jié)果采用HPLAS－100彩色圖像分析系統(tǒng)進行分析，表達(dá)強度用平均吸光度值表示，以上實驗重復(fù)2次。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析及Pearson積差相關(guān)分析mRNA和蛋白的相互關(guān)系，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果 在低氧條件下培養(yǎng)0、12、24和72 h后MICA mRNA/β-actin吸光度比值在不同刺激時間其表達(dá)的差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）,見表1、圖1。

表1 低氧刺激后MICA mRNA及蛋白的表達(dá)（n=4，±s）

表1 低氧刺激后MICA mRNA及蛋白的表達(dá)（n=4，±s）

**P＜0．01

時間（h）0 12 24 72 F MICA mRNA/β-actin mRNA 0.21±0.03 0.36±0.43 0.57±0.72 0.74±0.59 233.03**MICA吸光度值（A）57.50±5.05 95.92±8.91 153.37±11.98 266.81±18.16 690.58**

2．2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 低氧條件刺激0、12、24、72 h后，MICA蛋白的表達(dá)吸光度值在不同刺激時間其表達(dá)上調(diào)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1、圖2。

2．3 MICAmRNA表達(dá)與MICA蛋白水平Pearson積差相關(guān)分析顯示，MICA mRNA表達(dá)水平與MICA蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0．964，P＜0．05）。

3 討論

MIC基因有很強的多態(tài)性,目前已知MICA位點有54個等位基因。MICA屬于MIC基因家族，正常情況下僅表達(dá)于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表面。MICA基因的翻譯起始區(qū)存在類似熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）反應(yīng)的元件，而在組織細(xì)胞受到過度應(yīng)激（如熱休克、紫外線等）的情況下會誘生表達(dá)或上調(diào)表達(dá)。HSP是維持細(xì)胞內(nèi)蛋白構(gòu)象穩(wěn)定與功能正常所必需的分子伴侶，也是公認(rèn)的與應(yīng)激耐受密切相關(guān)的保護性分子[4],與體內(nèi)各種應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多個關(guān)鍵分子相互作用，增強細(xì)胞對損害的耐受程度，提高細(xì)胞的生存率，在抗凋亡作用中扮演重要角色。在氧化應(yīng)激條件下，熱休克反應(yīng)元件可在啟動子區(qū)上調(diào)MICA和MICB表達(dá)，說明該蛋白可在應(yīng)激條件下誘導(dǎo)表達(dá)，但MIC基因的表達(dá)不受干擾素（IFN）－γ的影響。MICA可能作為宿主防御反應(yīng)中的一個新成員，通過NK細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用在胃腸道黏膜的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，長期高血糖與胃黏膜損傷及損傷的程度有密切關(guān)系[6]。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激或細(xì)胞壞死時,HSP-肽復(fù)合物暴露在細(xì)胞表面或釋放入細(xì)胞外環(huán)境中,被周圍的抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）攝取，并通過獨特的MHCⅠ類途徑交叉呈遞到細(xì)胞表面，激發(fā)機體產(chǎn)生抗原肽非依賴的固有性免疫應(yīng)答和抗原肽依賴的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。后者主要是細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，在機體殺傷腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)受到低氧應(yīng)激因素的刺激時，基因調(diào)控?zé)嵝菘说鞍妆磉_(dá)升高的同時MICA也相應(yīng)上調(diào)表達(dá)，在本研究中也觀察到GES－1細(xì)胞受到低氧應(yīng)激刺激后MICA的上調(diào)現(xiàn)象。

MICA表達(dá)升高可介導(dǎo)機體MICA-NKG2D的免疫反應(yīng)，但有一部分發(fā)揮免疫穩(wěn)定和免疫監(jiān)視的作用。同時其表達(dá)上調(diào)以可溶性MICA（sMICA）的形式釋放下調(diào)NKG2D受體的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，sMICA可降低催乳素瘤患者NK細(xì)胞和T細(xì)胞NKG2D受體的表達(dá)[7]。Groh等[8]的研究表明，sMICA能誘導(dǎo)T細(xì)胞表面NKG2D的內(nèi)化和降解，并發(fā)現(xiàn)在胃腸惡性腫瘤患者的血清中含高水平的sMICA分子，從而認(rèn)為是這些從腫瘤細(xì)胞表面釋放的sMICA分子導(dǎo)致了NKG2D的下調(diào),并進一步嚴(yán)重影響了抗原特異性T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。sMICA通過限制活化信號的傳遞,對機體抗腫瘤免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)作用是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的機制之一。

本研究表明在低氧條件刺激下，GES-1中基因MICA以及與其蛋白水平的升高之間具有一定的相關(guān)性。MICA是一種可受應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子,其表達(dá)形式和水平的變化與機體免疫功能密切相關(guān)。筆者認(rèn)為，在低氧條件刺激后,細(xì)胞可能受到低氧應(yīng)激條件的刺激,誘發(fā)表達(dá)上調(diào)。其表達(dá)的升高一方面可以動員機體的免疫應(yīng)答起到防御的作用；另一方面其可溶性的MICA表達(dá)在體液可降低其受體的表達(dá)而抑制細(xì)胞免疫，為進一步的病理變化提供前提。目前,對于MICA的結(jié)構(gòu)與功能以及與疾病關(guān)系等方面的研究已取得重要的進展,但對其在高原低氧條件下表達(dá)調(diào)控機制的研究卻很少,尚有許多問題需要進一步研究。

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