上矢狀竇閉塞后水通道蛋白 -4表達與血 -腦脊液屏障破壞的關(guān)系

張忠玲,李國忠,陳旭輝,尹燕紅,宋 宇,趙秀麗

腦靜脈竇閉塞后會引起靜脈壓力升高,細胞間液和腦脊液之間的平衡失調(diào),導(dǎo)致嚴(yán)重威脅患者生命的腦水腫,尤其早期表現(xiàn)為血 -腦脊液屏障 (blood-brain barrier,BBB)破壞引起的血管源性腦水腫,臨床缺乏有效的治療方法。近年來研究發(fā)現(xiàn),廣泛分布于星形膠質(zhì)細胞軸突的水通道蛋白 -4(aquaporin 4,AQP-4)介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運,在腦梗死及腦出血后 AQP-4表達顯著增高,參與血管源性腦水腫的形成[1]。而關(guān)于腦靜脈閉塞的研究少見報道。本研究旨在探討大鼠上矢狀竇閉塞后 AQP-4在 BBB破壞中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型 選擇健康雄性 Wistar大鼠 49只,體質(zhì)量 250～300 g(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供)。采用隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為對照組和實驗組,實驗組又根據(jù)不同閉塞時間 3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d分為 6組,每組 7只,正常飲食 (哈醫(yī)大一院動物實驗中心提供)平衡 1周。參照 Schaller等[2]報道的方法,大鼠腹腔內(nèi)注射 10%水合氯醛 (350 mg/kg體質(zhì)量)全麻醉后,固定于立體定向儀上,在無菌條件下行額頂部開顱,骨窗為 0.5 cm×0.5 cm,暴露上矢狀竇,在顯微鏡下沿上矢狀竇后段兩側(cè)切開硬膜約 0.3 cm,使上矢狀竇后段游離,用絲線貫穿后在近竇匯 0.1 cm處結(jié)扎上矢狀竇后段,術(shù)后縫合皮膚,放回籠內(nèi),自由喂養(yǎng)。按不同閉塞時間處死大鼠,如實驗3 h組于結(jié)扎上矢狀竇后 3 h處死大鼠,其余各組依次類推。對照組 (假手術(shù)組)只暴露、游離上矢狀竇,絲線貫穿留置而不結(jié)扎。

1.2 腦組織含水量的測定 取各組大鼠 7只,處死后取腦,各組動物取相同部位額部皮質(zhì) 150 mg,稱濕重 (精確到 0.1 mg)后立即放入恒溫電烤箱內(nèi),溫度設(shè)置為 100℃,時間為24 h,然后稱取干重,用 Blliot公式:腦含水量 =(濕重 -干重)/濕重 ×100%,計算腦組織含水量。

1.3 BBB通透性測定 各組大鼠處死前 1 h尾靜脈注入 1.5%伊文氏藍 (Evan blue,EB)2 ml/kg,麻醉后心內(nèi)灌注 0.9%氯化鈉溶液 200～250 ml,斷頭取腦,放置于 5 ml甲酰胺中孵育 24 h,收集上清液,用 756分光光度計 (620 nm)測得吸光度,依照 EB/甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品計算出腦組織 EB含量 (μg/g)。1.4 免疫組化檢測 AQP-4蛋白的表達 取各組大鼠 7只,0.9%氯化鈉溶液經(jīng)主動脈灌流沖洗血液,再用 4%多聚甲醛200 ml灌注固定,取腦放入 20%蔗糖 PBS液中 4℃過夜脫水,次日,將標(biāo)本置于恒冷冰凍切片機行冠狀連續(xù)切片,片厚 6 μm,冰凍切片經(jīng) H2O2處理 10 min后,用 10%正常羊血清封閉 30 min,一抗 (濃度為 1∶250)為兔抗大鼠 AQP-4單克隆抗體 (武漢 Boster生物技術(shù)公司),室溫下孵育過夜,ABC試劑盒 (北京中山公司)按說明書進行操作,DAB顯色系統(tǒng)閉光顯色后光鏡觀察,AQP-4蛋白陽性細胞為神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色沉淀物,計數(shù)每平方毫米中陽性細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以 (x±s)表示,采用 t檢驗和相關(guān)性分析,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織含水量及 EB含量的比較 腦組織含水量在上矢狀竇閉塞 6 h開始增加,持續(xù)升高 3 d達到高峰,后逐漸回落,實驗 6 h、12 h、24 h、3 d、7 d組與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。與對照組相比,實驗組腦組織EB含量在 6 h、12 h、24 h、3 d時明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05),24 h時 EB含量達到高峰 (見表 1)。

2.2 各組 AQP-4表達情況的比較 對照組相同部位可見AQP-4表達呈弱陽性,上矢狀竇閉塞后各時相點水腫腦組織均有不同程度 AQP-4陽性表達細胞。AQP-4表達在上矢狀竇閉塞后 6 h開始上調(diào),24 h達高峰,維持 3 d時開始逐漸回落,除 3 h外,實驗組各時相點相同部位 AQP-4的表達與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05,見表 1)。

2.3 AQP-4表達與腦組織含水量的相關(guān)性分析表明,兩者呈正相關(guān) (r=0.846,P＜0.01)。

表 1 對照組與實驗組大鼠腦組織含水量和 EB含量及 AQP-4表達情況比較 (x±s)Table 1 Comparison of brain water content,concentration of EB,AQP-4 expression between control group and test groups

3 討論

腦水腫是腦靜脈竇閉塞后最主要的病理變化,腦靜脈竇閉塞后腦水腫的形成是一個十分復(fù)雜的過程,目前的研究還遠不能清楚地闡明。血管源性腦水腫是由于 BBB開放或破壞、血管通透性增加導(dǎo)致血漿蛋白、水分和電解質(zhì)等向血管外滲出引起的細胞間質(zhì)水腫,是腦靜脈竇閉塞后早期的病理生理特征[3]。以往研究發(fā)現(xiàn),AQP-4在與毛細血管和軟腦膜直接接觸的神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管周圍表達豐富,這些分布特點表明AQP-4是 BBB水調(diào)節(jié)和運輸?shù)闹匾Y(jié)構(gòu),與 BBB的通透性有密切關(guān)系[4]。

本研究結(jié)果顯示,上矢狀竇閉塞后 3 h腦組織含水量即有增加的趨勢,實驗6 h組與對照組比較有差異,而代表 BBB損傷的 EB含量與 AQP-4表達的增加均在上矢狀竇閉塞后 6 h,這提示上矢狀竇閉塞后極早期 (6 h以內(nèi))腦組織含水量的增加可能與 AQP-4表達及 BBB的改變無關(guān),而是由于靜脈側(cè)支通路的開放,靜脈壓升高,腦脊液回流受阻,導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高,從而引起腦組織含水量的增加,是一種流體靜力性腦水腫。上矢狀竇閉塞后 24 h,EB含量與 AQP-4表達達到最高峰,腦組織含水量也明顯增加,說明 AQP-4的增高與 BBB的破壞有直接關(guān)系,是血管源性腦水腫形成的關(guān)鍵機制。相關(guān)性分析表明 AQP-4表達與腦組織含水量呈正相關(guān)。但是,上矢狀竇閉塞后腦組織含水量在第 3 d達到高峰,與 AQP-4表達的高峰并不一致,說明還有其他的機制參與腦水腫的形成,我們推測隨著上矢狀竇閉塞時間的延長,動脈血流減慢,局部腦血流量減少,腦組織缺血、缺氧,能量代謝衰竭,細胞膜破壞,離子和水分子進入細胞內(nèi),導(dǎo)致細胞毒性腦水腫,使腦水腫進一步加重,這符合腦靜脈梗死的病理生理特點,即早期出現(xiàn)血管源性腦水腫,隨后出現(xiàn)細胞毒性腦水腫[3]。

由此可見,AQP-4增高是 BBB的破壞及血管源性腦水腫的重要因素,抑制 AQP-4的表達將達到緩解腦水腫的目的。有研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注后,激活的蛋白激酶 C(PKC)可以使 AQP-4磷酸化,磷酸化后的 AQP-4生物活性喪失,從而減輕腦水腫,但是 PKC的激活也可以直接引起 BBB的通透性增加,加重腦水腫[5],因此推測,機體可能存在一套調(diào)節(jié)AQP-4與 PKC之間平衡的機制,有必要進一步深入研究。總之,本研究結(jié)果提示,上矢狀竇閉塞后 AQP-4表達增高是 BBB破壞的原因之一,如果能在早期抑制 AQP-4的表達,可能會保護 BBB和減輕血管源性腦水腫。

1 Badaut J,Lasbennes F,Magistretti PJ,et al.Aquaporins in brain:distribution,physiology,and pathophysiology[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22:367-378.

2 Schaller B,Graf R,Sanada Y,et al.Hemodynamic changesafter occlusion of the posterior superior sagittal sinus:an experimental PET-study in rat[J].AJNR,2003,24:1876-1880.

3 Rottger C,Trittmacher S,Gerriets T,et al.Reversible MR imaging abnormalities following cerebral venous thrombosis[J].Am J Neuroradiol,2005,26:607-613.

4 唐宇平,蔡定芳,劉軍,等 .急性腦出血血腫周圍組織水通道蛋白 -4表達與血腦屏障損傷的關(guān)系 [J].中華神經(jīng)科雜志,2005,38(11):704-707.

5 Verkman AS,Binder DK,Bloch O,et al.Three distinct roles of aquaporin-4 in brain function revealed by knockout mice[J].Biochim Biophys Acta,2006,1758:1085-1093.