小鼠腦缺血再灌注后地塞米松對(duì)海馬CA 1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

邢春平,趙嘉訓(xùn)

低循環(huán)灌注(不完全性缺血)或循環(huán)停止(完全性缺血)后再灌注腦損傷為臨床急救復(fù)蘇中經(jīng)常面臨的問(wèn)題。糖皮質(zhì)激素因其減輕炎癥反應(yīng)、改善腦水腫和清除自由基等作用,常被用于臨床腦保護(hù)和腦復(fù)蘇,但其在再灌注損傷后的治療效果究竟如何,臨床目前還未見到隨機(jī)、前瞻性的比較研究報(bào)道。激素在缺血性腦血管病中的應(yīng)用一直是腦血管病治療中頗有爭(zhēng)議的問(wèn)題。20世紀(jì)90年代有學(xué)者[1]認(rèn)為糖皮質(zhì)激素有減輕缺血性腦損傷的作用,后來(lái)也有人[2]認(rèn)為藥理劑量的糖皮質(zhì)激素可加重缺血性腦損傷,對(duì)腦缺血再灌注損傷后糖皮質(zhì)激素的治療作用研究報(bào)道更少。關(guān)于給藥時(shí)間,文獻(xiàn)報(bào)道中多為預(yù)先給藥,與臨床實(shí)際差距較大。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法[3]制造大鼠前腦缺血模型,擬從神經(jīng)病理學(xué)的角度觀察大劑量地塞米松對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷后早期用藥的作用,以觀察海馬CA1區(qū)病理改變,其中主要以觀察神經(jīng)元細(xì)胞的病理變化,明確地塞米松對(duì)改善腦缺血再灌注的效果。從而為臨床提供確實(shí)可靠的證據(jù)以及新的治療方法,就雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法而言,較單側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷法更具臨床價(jià)值[4,5],更接近于臨床。所以本研究具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康昆明小鼠54只,雌雄各半,體質(zhì)量20 g±2 g,由山西省腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組 按隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分為9組,每組6只,假手術(shù)組(I):僅游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈;生理鹽水對(duì)照4組(N1,N2,N3,N4):絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈,1 h后松開,再灌注0 h、0.5 h、1 h、1.5 h后經(jīng)尾靜脈分別給予相當(dāng)量的生理鹽水;地塞米松干預(yù)4組(D1,D2,D3,D4):絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈,缺血1 h后松開,再灌注0 h、0.5 h、1 h、1.5 h后經(jīng)尾靜脈分別給予地塞米松10 mg/kg。以上9組均采取再灌注24 h后斷頭取腦。

1.2.2 模型及病理標(biāo)本的制備 在室溫25℃、濕度50%的條件下進(jìn)行腦缺血再灌注手術(shù),用0.6%的戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射后,將小鼠仰臥位固定,彎剪去毛,作頸部正中切口約1 cm,鈍性分離下頜下腺,將其向上翻起,暴露胸鎖乳突肌,在其后內(nèi)側(cè),氣管后外側(cè),分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈,穿3-0絲線備用,輕輕提拉備用線,用絲線打活結(jié)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈將其阻斷,即為缺血開始,達(dá)到1 h后,松開線結(jié)即為再灌注開始。用慶大霉素沖洗術(shù)野,3-0絲線縫皮,置清潔飼養(yǎng)籠中觀察,并分別行各個(gè)時(shí)間段地塞米松及生理鹽水尾靜脈注射。24 h后苯巴比妥鈉腹腔麻醉,依次以溫生理鹽水,40 g/L多聚甲醛進(jìn)行左心室灌注,然后迅速斷頭取腦,繼續(xù)用中性甲醛溶液固定24 h,取視交叉到乳頭體后部之間的腦組織,然后進(jìn)行常規(guī)脫水,浸蠟,透明,包埋,切片厚度5μm,每腦取相當(dāng)于前囟點(diǎn)(Bregma點(diǎn))-2.12mm,-2.56 mm平面片2張,行H E染色。在有測(cè)微尺顯微鏡(×10)的光鏡下,計(jì)數(shù)海馬CA 1區(qū)2 mm范圍內(nèi)核完整的錐體細(xì)胞數(shù)(自CA 1區(qū)始點(diǎn)起)。

1.2.3 模型制備標(biāo)準(zhǔn) 在結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈后,以出現(xiàn)驚厥、呼吸深慢、心跳加快為成功標(biāo)準(zhǔn)[6]。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià) 雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷后,用于再灌注觀察的小鼠,于麻醉清醒后出現(xiàn)了輕重不同的神經(jīng)功能缺損癥狀。進(jìn)行蘇木精-伊紅染色的大鼠腦片均出現(xiàn)了輕重不等的神經(jīng)細(xì)胞變性改變。

2.2 形態(tài)學(xué)結(jié)果 腦缺血再灌注后腦組織形態(tài)學(xué)改變。假手術(shù)組海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,海馬CA 1區(qū)錐體細(xì)胞呈橢圓形,核染色質(zhì)稀疏,核仁清楚;生理鹽水組海馬組織學(xué)圖片,細(xì)胞數(shù)量明顯下降,變性細(xì)胞數(shù)明顯增多,可見許多神經(jīng)元出現(xiàn)明顯形狀上的改變,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞體積縮小,胞漿濃縮,染色質(zhì)凝集,嗜酸色染色增強(qiáng)。缺血再灌注地塞米松組病變神經(jīng)元數(shù)較假手術(shù)組明顯減少。

2.3 各組海馬CA 1區(qū)2 mm范圍內(nèi)核完整的正常錐體細(xì)胞數(shù)(見表1)

表1 各組小鼠海馬CA 1區(qū)2 mm正常錐體細(xì)胞數(shù)(±s)

表1 各組小鼠海馬CA 1區(qū)2 mm正常錐體細(xì)胞數(shù)(±s)

組別n正常錐體細(xì)胞數(shù)(個(gè))I 12 23.080±3.147 12 12.420±2.353 D1 12 22.583±2.429 D2 12 20.917±1.975 D3 12 18.917±1.564 D4 12 18.250±1.357 N

3 討 論

糖皮質(zhì)激素被廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管病的治療,地塞米松是經(jīng)典的合成類糖皮質(zhì)激素,具有代表性。關(guān)于給藥時(shí)間,文獻(xiàn)報(bào)道中多為預(yù)先給藥,與臨床實(shí)際差距較大。本研究采取再灌注后給藥,而且采取大劑量地塞米松(10 mg/kg)經(jīng)尾靜脈不同時(shí)間點(diǎn)注射,頗具臨床價(jià)值。從數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看,地塞米松組明顯較生理鹽水組正常細(xì)胞數(shù)多,變性細(xì)胞數(shù)少;地塞米松4組,隨用藥時(shí)間點(diǎn)的推移,正常細(xì)胞數(shù)逐漸減少,變性細(xì)胞數(shù)逐漸增多。

大劑量地塞米松在腦缺血再灌注早期用藥療效明顯,而且用藥越早療效越好。此結(jié)論也為臨床用藥提供了有力的證據(jù)。

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