ICU機械通氣性鮑曼氏不動桿菌感染的同源性分析

趙顏忠，周建黨

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙410013）

機械通氣技術(shù)是ICU病房常用的醫(yī)療技術(shù)，它在許多急危重患者的搶救中發(fā)揮了極其重要的作用。然而，由于人工氣道的建立，嚴(yán)重影響了人體呼吸系統(tǒng)的正常菌群，破壞機體的防御功能，極易發(fā)生肺部感染。國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道，由機械通氣所引起的呼吸道感染的發(fā)生率在50%以上，死亡率可達(dá)33%～71%[1-2]。鮑曼氏不動桿菌作為機械通氣性肺炎主要病原菌之一，由于其產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶，對多種抗生素具有高耐藥性，臨床治療療效不佳[3]。為探討鮑曼氏不動桿菌感染引起的機械通氣性肺炎、流行狀況，本研究對湘雅三醫(yī)院32例ICU病房鮑曼氏不動桿菌引起的機械通氣性肺炎進(jìn)行了基因分型與聚類分析，現(xiàn)如下報告。

1 材料和方法

1.1 一般資料

本組病例為中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院2009年8月～2009年10月32例機械通氣術(shù)后，鮑曼氏不動桿菌引起的下呼吸道感染患者。其中男性19例，女性13例，平均機械通氣時間11.2＋4.6天。本組患者治愈14例（40.0%），好轉(zhuǎn)8例（25.0%）。自動出院 3例（15.0%）、死亡 7例（20.0%）。

1.2 培養(yǎng)基 血平板、巧克力平板、中國蘭平板購自英國OXOID。

1.3 引物的設(shè)計與合成

隨機引物設(shè)計一條含10bp的引物，序列為5'-ACCGTGACTG-3',由上海Songon生物工程公司合成。

1.4 儀器

美國Biometra公司PC-Persnol Cycler，生物梅里埃VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定儀。

1.5 DNA提取

分離株置普通瓊脂糖培養(yǎng)基37℃過夜，挑2～3個單個菌落加入100μL裂解液中，煮沸10min，12000r/min離心5min,取2μL DNA提取液。

1.6 PCR反應(yīng)

反 應(yīng) 體 系 25μL， 包 括 10 x Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL 2.5μL，200mmol/L dNTP 0.5μL，Primer 0.5μL,2.5U/μl Taq 酶 0.2μL，DNA 2μL，雙蒸水 16.8μL。 反應(yīng)條件 94℃ 5min，36℃ 5min，72℃5min 循環(huán) 5 次，94℃ 1min，36℃1min，72℃2min 循環(huán)30次，72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在15%瓊脂糖凝膠中，電流60V，電泳2h后EB染色紫外燈下觀察結(jié)果，并照相分析。

2 結(jié)果

2.1 氣管導(dǎo)管性肺炎鮑曼氏不動桿菌感染RAPD基因分型

32株鮑曼氏不動桿菌經(jīng)RAPD擴增后得到DNA片段的條帶32條，每條帶清晰可辨，見圖1。

圖1 部分鮑曼氏不動桿菌RAPD電泳圖

2.2 聚類分析

32株鮑曼氏不動桿菌產(chǎn)生的擴增條帶數(shù)在4～8之間，形成指紋圖譜。將RAPD-DNA指紋圖按擴增帶的有無以0、1進(jìn)行排列,輸入計算機,以應(yīng)用算術(shù)平均數(shù)的非加權(quán)成組配對法進(jìn)行聚類分析,相似系數(shù)大于75%歸為一個基因型,共分為5個基因型，其中Ⅰ型 16 株,分別為 1、3、4、9、10、15、17、18、19、26、27、28、29、30、31、32 號，Ⅱ型 1 株,為 20號，Ⅲ型 2 株,為 23、24 號，Ⅳ型 4 株,為 2、6、16、22號，Ⅴ型 9 株，分別為 5、7、8、11、12、13、14、21、25號。

圖2 32株鮑曼氏不動桿菌聚類分析圖

3 討論

鮑曼氏不動桿菌多處于潮濕或干燥表面,并可在正常人皮膚上定植，醫(yī)院中蒸餾水容器、瓶裝水、靜脈營養(yǎng)液、濕化器吸引管、沖洗液人工通氣裝置等易受到該菌污染。該菌一般不致病，野生型鮑曼氏不動桿菌通常對抗生素敏感，但在抗生素的作用下，其極易誘導(dǎo)成多重耐藥與高耐藥性菌株。

機械通氣是搶救急危重呼吸功能衰竭患者生命的重要措施，但機械通氣患者也大大增加了患者的肺部感染及多器官損害的危險。鮑曼氏不動桿菌作為引起機械通氣肺炎的一種主要病原菌，特別是近年來，在ICU、老年患者及免疫功能低下患者的呼吸道感染中占有重要的地位[4]。本組32例鮑曼氏不動桿菌引起機械通氣患者肺部感染患者中，22例患者得以成功的救治或好轉(zhuǎn)，這雖然為機械通氣在搶救嚴(yán)重呼吸功能衰竭中的作用提供了佐證，但也不能不引起注意，7例患者未能搶救成功，與國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)報道相似，這些問題值得認(rèn)真研究、探討。

機械通氣肺部感染為醫(yī)院內(nèi)獲得性感染，分析、探討其傳播途徑、病原菌的來源等因素，對于臨床抗感染治療，預(yù)防感染的發(fā)生及及時、有效的控制感染具有重要意義。RAPD采用隨機選擇的單一引物通過DNA擴增，獲得細(xì)菌基因組指紋圖譜，通過對指紋圖譜的分析來研究細(xì)菌的基因分型、克隆、鑒定或分類等同源性相關(guān)情況[5-6]。本組32株鮑曼氏不動桿菌所得到的RAPD指紋圖譜與聚類分析，可以將其為5個基因型，其中Ⅰ型16株，Ⅴ型9株，占本次研究標(biāo)本的78.1%，說明這2型鮑曼氏不動桿菌是我院ICU病房的主要感染克隆傳播株，應(yīng)引起臨床的高度重視，加強監(jiān)控，防止爆發(fā)流行。

機械通氣性肺炎是臨床一個十分棘手的難題，鮑曼氏不動桿菌作為引起機械通氣性肺炎的一種主要病原菌，其不僅耐藥性高，還具有對多種抗生素耐藥的特征，分子流行病學(xué)研究證實鮑曼氏不動桿菌在醫(yī)院內(nèi)均存在克隆傳播,但主要是通過醫(yī)院環(huán)境接觸還是經(jīng)人與人之間直接傳播目前尚無定論[7-8]。因此，定期對重癥監(jiān)護(hù)病房機械通氣性肺炎病原菌的監(jiān)控與分子生物學(xué)分析，包括醫(yī)院內(nèi)環(huán)境、醫(yī)護(hù)人員手等因素的流行病學(xué)調(diào)查，防止醫(yī)院內(nèi)大規(guī)模流行，值得進(jìn)一步研究、探討。

[1]熊懷民,吳承.重癥監(jiān)護(hù)病房下呼吸道獲得性細(xì)菌感染的臨床調(diào)查分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2005,15(3):269-271.

[2]林賽玲,肖艷輝,徐金花.ICU痰標(biāo)本分離鮑曼氏不動桿菌的藥敏分析[J].中國實用醫(yī)藥，2009,4(33):10-11.

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[4]李希濤,周秀麗,張靜.臨床感染鮑曼氏不動桿菌及多重耐藥性分析[J].中國實驗診斷學(xué)，2008,12(1):130-131.

[5]丁進(jìn)亞,靳桂敏,曹軍皓,等.老年病區(qū)銅綠假單胞菌遺傳聚類分析[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2006,22(2):216-217.

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