芹菜素增強TRAIL誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡

劉杰 ，唐愛瓊 ，劉飛 ，曹建國 ，陳忠東 ?

（1.南華大學第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；2.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙，410013）

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠選擇性誘導癌細胞和惡性轉(zhuǎn)化細胞凋亡，對正常組織細胞細胞毒性微弱的內(nèi)源性細胞因子[1]。芹菜素(apiginin,API)是一種廣泛存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物，具有體內(nèi)外腫瘤預防作用[2]。本文旨在研究API與TRAIL合用對人宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 芹菜素(apigenin,API)由美國Sigma公司出品；重組人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)由英國PeproTech公司生產(chǎn)；碘化丙啶（PI）由美國英杰生物技術(shù)公司出品；DNA Ladder檢測凋亡試劑盒購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 流式細胞術(shù)分析 取對數(shù)生長期HeLa細胞，培養(yǎng)24h待細胞貼壁，用含0.1%的小牛血清的培養(yǎng)基處理24h進行細胞周期同步化后，分別加入含標示終濃度受試物的完全培養(yǎng)基作用48h；0.1%DMSO作為溶媒對照。0.25%胰蛋白酶消化，收集所有細胞于1.5mL EP管中，用4℃的75%乙醇固定24h后，經(jīng)碘化丙啶（PI）染色，用流式細胞儀測定細胞DNA含量。以上實驗重復2次。

1.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳 取對數(shù)生長期HeLa細胞，分別加入含標示終濃度受試物的完全培養(yǎng)基作用48h；0.1%DMSO作為溶媒對照。細胞收集于1.5mL EP管中用于提取DNA。按北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司凋亡細胞DNA ladder檢測試劑盒說明書步驟分別提取DNA，置于4℃冰箱過夜。再將提取的DNA樣品5μL與6×Buffer 1μL混勻后，加到1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，最后在Alphaimager TM 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并攝影。以上實驗重復2次。

1.5 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)錄入Spss 15.0 for windows evaluation軟件，建立數(shù)據(jù)庫，各組實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，用One Way ANOVA行方差分析。P＜0.05為統(tǒng)計學意義顯著標準。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素、TRAIL及兩者合用對人宮頸癌HeLa細胞Sub-G1百分率影響

PI染色FCM分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)以及兩者合用的人宮頸癌HeLa細胞 sub-G1百分率分別是 3.56%±0.20%、6.69%±0.40%和59.8%±4.20%。兩者合用的sub-G1細胞百分率是API(20μmol/L)與TRAIL(20ng/mL)單獨使用是sub-G1細胞百分率之和的583%(P＜0.05,圖1)。提示，亞細胞毒性濃度的API能夠有效促進TRAIL導致人宮頸HeLa細胞凋亡。

圖1 亞細胞毒性濃度的API和TRAIL兩者合用對HeLa細胞sub-G1百分率的影響

2.2 芹菜素、TRAIL及兩者合用對人宮頸癌HeLa細胞DNA核小體間斷裂的影響

DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示：單用芹菜素20μmol/L或 TRAIL20 ng/mL孵育 HeLa細胞 48h，未見典型DNA梯形條帶(圖2)；然而，用20μmol/L的芹菜素預孵育4h，再加入20 ng/mL的TRAIL處理44h，展示出典型DNA梯形條帶圖譜(圖2)。證實：亞細胞毒性濃度的芹菜素具有顯著增強TRAIL誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡作用。

3 討論

圖3 亞細胞毒性濃度的芹菜素、TRAIL及兩者合用對人宮頸癌HeLa細胞DNA梯形條帶的影響

最近，朱琳等[3]檢測了宮頸癌細胞HeLa表面TRAIL死亡受體 (DR4、DR5)及誘餌受體(DcR1、DcR2)的表達差異,結(jié)果表明,HeLa表面DR4、DR5受體mRNA的表達明顯高于DcR1、DcR2受體。Ryu等[4]用Western blotting檢測TRAIL受體在宮頸癌與正常宮頸組織中的表達,實驗表明在正常宮頸組織中誘騙受體及死亡受體均有表達,而在宮頸癌中死亡受體的表達高于誘騙受體,這與正常細胞逃逸TRAIL誘導的凋亡機制一致。并且,TRAIL在宮頸癌組織中誘導腫瘤細胞凋亡的過程不依賴于P53。 因此，TRA IL的發(fā)現(xiàn)給腫瘤包括宮頸癌的治療帶來了希望。目前的以及已經(jīng)集中在如何提高TRAIL在不敏感腫瘤細胞系的敏感性？

有研究表明，芹菜素具有促進人胃癌BGC-823細胞凋亡作用，呈濃度依賴性。芹菜素主要通過活化線粒體途徑誘導BGC-823凋亡[5]。芹菜素還可誘導人宮頸癌細胞HeLa的G1期阻滯和細胞凋亡，這與細胞 p21/WAF1、Fas/APO-1、caspase-3 的表達增加，以及Bcl-2表達減少有關(guān)[6]。最近，Horinaka報道：芹菜素通過上調(diào)DR5增強TRAIL誘導人白血病細胞、人前列腺癌細胞和人結(jié)腸癌細胞凋亡作用[7]。因此，本文研究的主要目的是觀察芹菜素增強TRAIL誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡作用。

本文首先采用PI染色FCM分析芹菜素、TRAIL、以及兩者合用對HeLa細胞sub-G1百分率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)以及兩者合用的HeLa細胞sub-G1百分率分別 是 3.56%±0.20%、6.69%±0.40%和 59.87%±4.20%。提示，亞細胞毒性濃度的API能夠有效促進TRAIL導致人宮頸癌HeLa細胞凋亡。

細胞凋亡的另一個主要生物化學特征是凋亡的細胞DNA發(fā)生非隨機性的核小體間剪切，在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)出典型DNA梯形條帶。為了確證芹菜素對TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的增敏作用，我們用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測芹菜素、TRAIL及兩者聯(lián)合對人宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：用20μmol/L的芹菜素預孵育4h，再加入20 ng/mL的TRAIL處理44h，展示出典型DNA梯形條帶圖譜(圖2)。證實亞細胞毒性濃度的芹菜素具有顯著增強TRAIL誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡作用。

總之，本文的研究結(jié)論是無基因毒性的黃酮類化合物芹菜素在亞細胞毒性濃度下能夠顯著增強TRAIL誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡作用。本文的以及結(jié)果彰顯了聯(lián)合應用芹菜素和TRAIL是有希望的治療人宮頸癌的新型方案的特性。

[1]Zhang T,Wu M,Chen Q,et al Z.Investigation into the regulation mechanisms of TRAIL apoptosis pathway by mathematical modeling[J].Acta Biochim Biophys Sin，2010，42(2):98-108.

[2]Tsai CH,Lin FM,Yang YC,et al.Herbal extract of Wedelia chinensis attenuates androgen receptor activity and orthotopic growth of prostate cancer in nude mice[J].Clin Cancer Res， 2009， 15(17):5435-54~44.

[3]朱琳,李慧榮,吳建,等.宮頸癌細胞TRAIL死亡受體和誘騙受體表達的研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2005,14(4):277-280.

[4]Ryu HS,Chang KH.Expression of TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)receptors in cervical cancer.[J].Int J Gynecol Cancer,2000,10(5):417-424.

[5]胡太平,曹建國.芹菜素誘導人胃癌細胞凋亡作用及機制研究 [J].國際病理科學與臨床雜志,2007,27(10):6-10.

[6]Zheng PW,Chiang LC,Lin CC.Apigenin induced apoptosis through p53-dependent pathway in human cervical carcinoma cells[J].Life Sci,2005,76(12):1367-1379.

[7]Horinaka M,Yoshida T,Shiraishi T,Nakata S,Wakada M,Sakai T.The dietary flavonoid apigenin sensitizes malignant tumor cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Mol Cancer Ther,2006，5(4):945-951.