SLE患者外周血T細(xì)胞亞群凋亡特點(diǎn)及其相關(guān)機(jī)制的研究①

王曉樂(lè) 邱潮林 吳秀梅 季曉輝 張冬青 (上海市公利醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200135)

SLE是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病,免疫學(xué)異常主要表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞依賴的B細(xì)胞功能亢進(jìn),大量致病性自身抗體及免疫復(fù)合物產(chǎn)生。T細(xì)胞亞群凋亡異常是導(dǎo)致SLE T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂和免疫應(yīng)答異常的重要機(jī)制[1]。已證實(shí),活化的T細(xì)胞發(fā)生激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(Activation-induced cell death,AICD),導(dǎo)致T細(xì)胞免疫應(yīng)答功能紊亂,加速了SLE病理進(jìn)程。Fas介導(dǎo)的死亡信號(hào)受體途徑是T細(xì)胞發(fā)生AICD的主要途徑,Fas與之在體內(nèi)的天然配體FasL相結(jié)合從而發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用。大量研究表明,IL-10是有效的T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞的抑制因子,SLE患者血清IL-10水平異常升高,很可能促進(jìn)了異?；罨腡細(xì)胞高表達(dá)FasL,T細(xì)胞膜表面FasL通過(guò)膜內(nèi)陷或折疊與自身或鄰近T細(xì)胞Fas結(jié)合引起了AICD[2]。2005年Wang H等報(bào)告:SLE患者PBMCs中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群凋亡均明顯增加;體外SLE患者血清可誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群凋亡增多;SLE患者PBMCs培養(yǎng)上清中sFas、sFasL水平升高;細(xì)胞內(nèi)Fas mRNA的表達(dá)水平升高[3]。本研究探討了不同病程階段SLE患者T細(xì)胞亞群發(fā)生凋亡的特點(diǎn),以及 IL-10與T細(xì)胞亞群凋亡之間的聯(lián)系,試圖更深入地闡明SLE T細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 選取2005年4月至2008年4月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州二院風(fēng)濕免疫科就診的SLE患者,共45例,均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)1997年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[4],活動(dòng)性判定以多倫多大學(xué)的SLE活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)為標(biāo)準(zhǔn)[5]。其中的35例SLE患者按疾病活動(dòng)性分成兩組,包括:高活動(dòng)性患者(SLEDAI≥10)25例,男性 2例、女性 23例,年齡19～58歲、平均(36±9)歲;低/非活動(dòng)性患者(SLEDAI＜10)10例,包括男性2例、女性 8例,年齡17～53歲、平均(38±11)歲。35例SLE患者臨床檢驗(yàn)改變特點(diǎn)見(jiàn)表1。另外10例SLE患者進(jìn)行跟蹤試驗(yàn):其中初診患者5例,均為女性,年齡19～68歲、平均(39±21.51)歲;SLE活動(dòng)期(SLEDAI≥10)患者5例,其中 1例為男性,年齡 18～57歲、平均(33.8±15.16)歲。從以上45例SLE患者中選取10例血清IL-10水平升高(IL-10≥20)的患者進(jìn)行體外抗體中和實(shí)驗(yàn),均為女性,年齡22～46歲、平均(34.70±8.92)歲。20例正常人對(duì)照選自來(lái)我院健康體檢合格者,包括男性3例、女17例,年齡23～53歲、平均(32±7)歲。

1.2 主要試劑 血清抗ds-DNA抗體放射免疫分析試劑盒為北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。血清IgG、C3、C4檢測(cè)試劑為芬蘭Orion診斷公司產(chǎn)品。人血清IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒、熒光標(biāo)記抗體包括抗CD4-FITC、抗CD8-PE、抗 CD3-PerCP以及 PE-Cy5標(biāo)記的CD3、CD4、CD8單抗及其同型對(duì)照單抗、FITC標(biāo)記的Fas單抗及小鼠IgG1同型對(duì)照單抗、PE標(biāo)記的FasL單抗及小鼠IgG1同型對(duì)照單抗、Annexin V-FITC凋亡試劑盒等均為上海晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。純化的IgG1類鼠抗人IL-10單克隆抗體及其同型對(duì)照為Biolegend公司產(chǎn)品。純化的IgG1類鼠抗人FasL單克隆抗體及其同型對(duì)照為Biolegend公司產(chǎn)品。RMPI Medium 1640,pH7.4,不含血清,為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清(FCS)為Biosource公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液為上海恒信化學(xué)試劑有限公司提供產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理 無(wú)菌條件下取SLE患者或正常對(duì)照者外周血10 ml,2 ml置于干燥管,收集血清,保存于-20℃冰箱中,用于血清IL-10的檢測(cè),檢測(cè)于凍存后一周內(nèi)完成;另外8 ml外周肝素鈉抗凝,其中2 ml用于相關(guān)流式檢測(cè),6 ml用于外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離培養(yǎng)。需注意:抗凝血應(yīng)及時(shí)放入25℃水浴箱中,且所有檢測(cè)、處理應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)完成。

1.3.2 T細(xì)胞亞群百分比例的檢測(cè) 取SLE患者或正常對(duì)照者肝素抗凝血1 ml,按照CD4/CD8/CD3熒光標(biāo)記單抗試劑盒的要求操作,流式細(xì)胞儀FACs Calibur由美國(guó)BD公司生產(chǎn),以FSC/SCC二維散射光圖確定淋巴細(xì)胞群體,檢測(cè)10 000個(gè)淋巴細(xì)胞,每例樣本設(shè)一組同型對(duì)照,利用功能軟件得到CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞亞群占總細(xì)胞數(shù)的百分比,并得到CD4+/CD8+比值。

表1 35例SLE患者主要臨床檢驗(yàn)指標(biāo)的變化特點(diǎn)(±s)Tab.1 The results of clinical examinations in 35 SLE patients(±s)

表1 35例SLE患者主要臨床檢驗(yàn)指標(biāo)的變化特點(diǎn)(±s)Tab.1 The results of clinical examinations in 35 SLE patients(±s)

Note:Compared with low-level active SLE group,1)P＜0.05;2)P＜0.01.

Groups n SLEDAI ds-DNA antibody binding rate(%) ESR(mm/h) WBC(109L-1) IgG(g/L) C3(g/L) C4(g/L)Hyperactive SLE 25 12.28±1.97 37.27±20.711) 47.60±17.492) 3.83±0.912) 18.66±4.872) 0.61±0.302) 0.13±0.082)Low-level active SLE 10 6.10±1.91 18.39±16.42 28.80±10.35 4.96±0.76 12.20±2.58 1.08±0.43 0.25±0.10

1.3.3 T細(xì)胞亞群早期凋亡的檢測(cè) PBMCs常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí)后,用3 ml PBS洗滌一遍,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,按Annexin V凋亡試劑盒操作要求,對(duì)CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞進(jìn)行Annexin V凋亡檢測(cè),在功能軟件上對(duì)AV+PI-的T細(xì)胞亞群作早期凋亡分析,每例樣本同時(shí)設(shè)立一組同型對(duì)照。

1.3.4 T細(xì)胞亞群Fas、FasL表達(dá)率的檢測(cè) 取SLE患者或正常對(duì)照者肝素抗凝血1 ml,按照試劑盒的操作要求,分別檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞Fas+/FasL+的表達(dá)率,每例樣本設(shè)一組同型對(duì)照。

1.3.5 SLE患者PBMCs常規(guī)培養(yǎng)中加入抗IL-10單抗后T細(xì)胞亞群Fas/FasL表達(dá)及早期凋亡的檢測(cè)

1.3.5.1 SLE患者PBMCs常規(guī)培養(yǎng)中加入抗IL-10單抗 按照PBMCs常規(guī)培養(yǎng)規(guī)程操作,24孔培養(yǎng)板上每孔PBMCs細(xì)胞懸液中加入3.0 μ l抗 IL-10單抗[6],置于37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。

1.3.5.2 PBMCs 48小時(shí)培養(yǎng)后的處理與檢測(cè) 用1 ml PBS稀釋成PBMCs細(xì)胞懸液,平均分裝于2支玻璃管中。一管中加入3 ml PBS洗滌一遍,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,再用PBS將PBMCs稀釋至5×105ml-1的濃度,用于T細(xì)胞亞群Fas、FasL表達(dá)率的檢測(cè),步驟詳見(jiàn)1.3.4;另一管中加入2 ml結(jié)合緩沖液洗滌一遍,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,再用結(jié)合緩沖液將PBMCs稀釋至5×105ml-1的濃度,用于流式T細(xì)胞亞群凋亡的檢測(cè),步驟詳見(jiàn)1.3.3。

1.3.6 SLE患者PBMCs常規(guī)培養(yǎng)中加入抗FasL單抗后T細(xì)胞亞群凋亡的檢測(cè)

1.3.6.1 SLE患者PBMCs常規(guī)培養(yǎng)中加入抗FasL單抗 按照PBMCs常規(guī)培養(yǎng)規(guī)程操作,24孔培養(yǎng)板上每孔PBMCs細(xì)胞懸液中加入2.0 μ l抗FasL單抗[7],置于37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。

1.3.6.2 PBMCs 48小時(shí)培養(yǎng)后的處理與檢測(cè) 用2 ml結(jié)合緩沖液洗滌PBMCs,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,再用結(jié)合緩沖液將PBMCs稀釋至5×105ml-1的濃度,用于流式T細(xì)胞亞群凋亡的檢測(cè),步驟詳見(jiàn)1.3.3。

1.3.7 血清IL-10檢測(cè) 取SLE患者或正常對(duì)照者外周血血清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟,ABC-ELISA法檢測(cè)血清中IL-10水平。

1.3.8 兩組SLE患者的跟蹤實(shí)驗(yàn) 跟蹤實(shí)驗(yàn)第一組:5例SLE初診患者,跟蹤其初發(fā)住院階段和治療兩個(gè)月后明顯好轉(zhuǎn)(退熱,蛋白尿減輕,皮膚、關(guān)節(jié)癥狀緩解,SLEDAI指數(shù)下降6分以上)階段;跟蹤實(shí)驗(yàn)第二組:5例SLE高活動(dòng)期患者,跟蹤其活動(dòng)階段(SLEDAI≥10)和一年后活動(dòng)性明顯降低(SLEDAI＜10)的穩(wěn)定階段。

①血清IL-10水平檢測(cè)操作步驟詳見(jiàn)1.3.7。②T細(xì)胞亞群Fas、FasL表達(dá)率的檢測(cè)操作步驟詳見(jiàn)1.3.4。③每例患者每個(gè)階段T細(xì)胞亞群早期凋亡的檢測(cè)操作步驟詳見(jiàn)1.3.3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析各組數(shù)據(jù),符合正態(tài)分布使用t檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布使用秩和檢驗(yàn),各組之間指標(biāo)比較使用兩個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn),相關(guān)分析使用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者外周血T細(xì)胞亞群的凋亡異常增多

SLE患者外周血T細(xì)胞亞群凋亡比正常人明顯增多(P＜0.05),以CD4+亞群更為顯著,結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

T細(xì)胞亞群的凋亡與SLE病情活動(dòng)性相關(guān),以CD4+亞群更為顯著:CD4+T細(xì)胞的凋亡在高活動(dòng)性組顯著高于低/非活動(dòng)性組(P＜0.05),且與SLEDAI呈正相關(guān)性(r=0.45,P ＜0.05)。T細(xì)胞亞群凋亡的不均一性導(dǎo)致T細(xì)胞亞群中CD4+T細(xì)胞比例下降,CD4+/CD8+的比值下降(P＜0.01),且高活動(dòng)性SLE組比低/非活動(dòng)性組更顯著(P＜0.05),結(jié)果見(jiàn)圖2。

表2 SLE患者外周血T細(xì)胞及其亞群凋亡的改變(±s)Tab.2 The apoptosis of T lymphocyte subsets in SLE patients(±s)

表2 SLE患者外周血T細(xì)胞及其亞群凋亡的改變(±s)Tab.2 The apoptosis of T lymphocyte subsets in SLE patients(±s)

Note:Compared with nomal controls group,1)P＜0.05;2)P＜0.01;Compared with low-level active SLE group,3)P＜0.05.

Groups n CD3+AV+PI- CD4+AV+PI- CD8+AV+PINormal controls 20 15.73±8.02 11.25±5.13 13.24±7.11 SLE patients 35 23.44±11.491) 16.88±8.771) 16.69±9.001)Hyperactive SLE 25 28.52±14.112) 21.89±12.642)3) 20.27±13.911)Low-level active SLE 10 20.87±9.79 12.08±5.91 13.98±7.89

2.2 SLE患者T細(xì)胞亞群膜表面Fas/FasL的表達(dá)率異常增高 SLE患者外周血T細(xì)胞膜表面Fas的表達(dá)率無(wú)論是在高活動(dòng)性組或低/非活動(dòng)組均明顯高于正常人(P＜0.01);FasL的表達(dá)率亦高于正常人,但主要表現(xiàn)在高活動(dòng)組(P＜0.01)。這其中,以CD4+T細(xì)胞亞群的Fas表達(dá)率增高最為顯著,尤其是在高活動(dòng)性組中,結(jié)果見(jiàn)表3。

SLE患者外周血T細(xì)胞膜表面Fas/FasL表達(dá)率的異常增高與SLE病情活動(dòng)性相關(guān),主要表現(xiàn)在高活動(dòng)性組中:Fas表達(dá)率與SLEDAI正相關(guān)(r=0.46,P＜0.05);FasL表達(dá)率與SLEDAI亦正相關(guān)(r=0.49,P＜0.05)。

2.3 SLE患者外周血T細(xì)胞高表達(dá)Fas/FasL與T細(xì)胞凋亡增多正相關(guān) 高活動(dòng)性SLE患者CD4+T細(xì)胞的凋亡增高與其高表達(dá)Fas(r=0.45,P＜0.05)、FasL(r=0.43,P＜0.05)和CD8+T細(xì)胞高表達(dá)FasL(r=0.42,P＜0.05)呈現(xiàn)正相關(guān)性;而CD8+T細(xì)胞的凋亡與其自身高表達(dá)Fas(r=0.48,P＜0.05)和FasL(r=0.49,P＜0.05)呈正相關(guān)。

將抗FasL單抗加入SLE患者PBMCs常規(guī)培養(yǎng)中后,SLE患者T細(xì)胞各亞群凋亡均明顯減少(P＜0.01),并以CD4+T細(xì)胞凋亡減少最為顯著,其凋亡平均減少率超過(guò)50%,明顯高于CD8+T細(xì)胞,且兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 SLE患者血清中異常增高的IL-10水平與T細(xì)胞凋亡密切相關(guān) SLE患者血清IL-10水平較正常人顯著升高(P＜0.01),高活動(dòng)性SLE患者與低/非活動(dòng)性患者比較更為明顯(P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1 SLE患者T細(xì)胞CD4+/CD8+亞群凋亡FACS結(jié)果Fig.1 FACS results of the apoptosis of T lymphocyte subsets(CD4+/CD8+)in SLE patients

表3 SLE患者T細(xì)胞CD4+和CD8+亞群 Fas/FasL的表達(dá)率(±s,%)Tab.3 The positive expression rates of Fas/FasL on T lymphocyte subsets in SLE patients(±s,%)

表3 SLE患者T細(xì)胞CD4+和CD8+亞群 Fas/FasL的表達(dá)率(±s,%)Tab.3 The positive expression rates of Fas/FasL on T lymphocyte subsets in SLE patients(±s,%)

Note:Compared with nomal controls group,1)P＜0.05,2)P＜0.01;Compared with low-level active SLE group,3)P＜0.05.

Groups n Fas+FasL+CD4+ CD8+CD4+ CD8+Nomal controls 20 11.56±4.78 7.64±3.42 0.27±0.16 0.45±0.39 SLE patients 35 16.11±7.491) 10.95±7.37 1.10±1.042) 0.92±0.642)Hyperactive SLE 25 16.54±8.151) 11.57±7.38 1.26±0.842)3) 0.97±0.672)Low-level active SLE 10 15.65±5.43 10.77±3.86 0.66±0.511) 0.72±0.531)

比較SLE患者血清IL-10水平與6個(gè)SLE主要臨床檢驗(yàn)指標(biāo)(血沉 、IgG 、C3、C4、WBC 、抗 ds-DNA 抗體)之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示:抗ds-DNA抗體與血清IL-10水平間的相關(guān)性最顯著(r=0.83,P＜0.01);高活動(dòng)組IL-10水平與IgG水平也呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性(r=0.41,P＜0.05)。SLE高活動(dòng)性組中,血清IL-10水平異常升高與SLEDAI具有一定的相關(guān)性(r=0.43,P＜0.05);與CD4+T細(xì)胞亞群的凋亡增加正相關(guān)(r=0.54,P＜0.05);與 T細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值下降負(fù)相關(guān)(r=-0.43,P＜0.05);與SLE T細(xì)胞亞群高表達(dá)Fas/FasL密切相關(guān),如表5所示。

圖2 SLE患者外周血T淋巴細(xì)胞及其亞群的百分含量Fig.2 The percentages of T lymphocyte subsets in SLE patients

圖3 10例高活動(dòng)期SLE患者PBMCs培養(yǎng)中加入抗FasL抗體T細(xì)胞亞群凋亡的改變Fig.3 The apoptosis of T lymphocyte subsets in 10 hyperactive SLE patients in the vitro inhibition experiments

SLE患者PBMCs培養(yǎng)時(shí)加入抗IL-10抗體后,T細(xì)胞亞群Fas/FasL的表達(dá)率減少(P＜0.05),CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞相比較,雖然前者Fas/FasL表達(dá)的平均減少率高于后者,但統(tǒng)計(jì)學(xué)上兩亞群無(wú)差異(P＞0.05)。加入抗IL-10抗體后,患者T細(xì)胞亞群凋亡下降(P＜0.05),CD4+T細(xì)胞平均凋亡減少率略高于CD8+T細(xì)胞,但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);CD4+/CD8+比例倒置得到一定改善(P＞0.05)。

2.5 SLE患者經(jīng)治療病情好轉(zhuǎn)、穩(wěn)定時(shí)伴有IL-10水平下降、Fas/FasL表達(dá)減少和T細(xì)胞凋亡減少 5例SLE初診患者血清IL-10水平隨著病情好轉(zhuǎn)逐漸減少(P＜0.05);T細(xì)胞亞群Fas/FasL的表達(dá)率也隨著病情好轉(zhuǎn)逐漸下降,其中Fas表達(dá)率減少以CD4+T細(xì)胞更明顯(P＜0.05),結(jié)果見(jiàn)表6;T細(xì)胞亞群細(xì)胞凋亡亦顯下降趨勢(shì),可能由于病例數(shù)較少,下降尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 SLE患者血清 IL-10水平(±s,pg/ml)Tab.4 The level of serum IL-10 in SLE patients(±s,pg/ml)

表4 SLE患者血清 IL-10水平(±s,pg/ml)Tab.4 The level of serum IL-10 in SLE patients(±s,pg/ml)

Note:Compared with normal controls group,1)P＜0.01;Compared with lowlevel active SLE group,2)P＜0.01.

Groups n IL-10 Normal controls 20 12.80±4.24 SLE patients 35 68.90±34.721)Hyperactive SLE 25 81.26±31.421)2)Low-level active SLE 10 33.38±11.841)

表5 35例 SLE患者血清IL-10水平與 T細(xì)胞亞群Fas/FasL表達(dá)率的相關(guān)性Tab.5 The correlations between serum IL-10 level and the positive expression rates of Fas/FasL on T lymphocyte subsets in SLE patients

表6 5例 SLE初診患者經(jīng)2個(gè)月治療病情好轉(zhuǎn)時(shí)IL-10水平(±s,pg/ml)及T細(xì)胞亞群Fas/FasL表達(dá)率(±s,%)的變化Tab.6 The level of serum IL-10(±s,pg/ml)and the positive expression rates of Fas/FasL(±s,%)on T lymphocyte subsets in a 2-month tracking experiment of first-visit SLE patients

Note:Compared with First-visit group,1)P＜0.05.

Clinical course n IL-10CD3+T cells CD4+T cells CD8+T cells Fas FasL Fas FasL Fas FasL First-visit 5 140.60±49.39 50.21±11.76 3.19±1.10 25.73±3.06 1.61±0.60 23.15±5.23 1.57±0.47 Improving phase 5 87.20±31.041)42.82±6.85 2.47±0.65 21.67±5.161) 1.01±0.34 20.08±5.85 1.39±0.54

圖4 SLE患者病情穩(wěn)定階段CD4+T細(xì)胞Fas+表達(dá)及凋亡的流式圖Fig.4 The apoptosis and Fas+expression rate of CD4+T lymphocytes in a stable SLE patient

5例SLE高活動(dòng)期患者跟蹤一年后隨著病情穩(wěn)定血清IL-10水平顯著下降(P＜0.01);T細(xì)胞亞群Fas/FasL表達(dá)率呈明顯下降趨勢(shì)(P＜0.05),尤其是CD4+T細(xì)胞Fas表達(dá)明顯下降(P＜0.01);CD4+T細(xì)胞亞群凋亡的減少亦尤為顯著(P＜0.05),結(jié)果如圖4所示。

3 討論

SLE是T細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞疾病,自身反應(yīng)性T細(xì)胞異常活化、機(jī)體的免疫耐受和免疫平衡被打破是SLE的主要發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)T細(xì)胞凋亡在SLE的病理進(jìn)程中的作用受到越來(lái)越多人的關(guān)注。SLE異?；罨腡細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡在某種程度上降低了自身免疫應(yīng)答反應(yīng),對(duì)病情緩解有一定的積極作用,但另一方面凋亡會(huì)產(chǎn)生能促使SLE自身免疫應(yīng)答的免疫物質(zhì),凋亡物質(zhì)寡聚核苷酸樣DNA與抗體形成的一系列免疫復(fù)合物沉積在組織中將導(dǎo)致組織損傷[8,9]。深入研究SLE T細(xì)胞凋亡機(jī)制及其與SLE疾病進(jìn)程的關(guān)系,以及相關(guān)調(diào)控因子的作用,將有助于深入認(rèn)識(shí)SLE的病程發(fā)展機(jī)制。

SLE T細(xì)胞凋亡的機(jī)制非常復(fù)雜,主要是通過(guò)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(AICD)途徑。Fas是介導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生AICD的主要受體分子,活化的T細(xì)胞膜表面Fas表達(dá)升高,與其配體FasL結(jié)合后,Fas的死亡域(DD)與胞漿內(nèi)接頭蛋白FADD(Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域)的DD發(fā)生同型作用,FADD又通過(guò)其死亡效應(yīng)域DED募集含DED的caspase 8,caspase 8的激活引起Caspase家族的一系列酶聯(lián)反應(yīng),引起DNA降解和鏡下可見(jiàn)的細(xì)胞及細(xì)胞核的凋亡形態(tài)學(xué)改變[10]。目前,對(duì)于SLE患者T淋巴細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道不盡相同[11-13]。SLE T淋巴細(xì)胞的凋亡很可能與SLE病情活動(dòng)度相關(guān),且不同亞群的凋亡狀態(tài)很可能不同。

通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血T細(xì)胞凋亡的3個(gè)主要特點(diǎn):CD4+亞群T細(xì)胞的凋亡異常顯著,且與SLE疾病活動(dòng)性正相關(guān);T細(xì)胞亞群膜表面表達(dá)Fas/FasL異常增高,且與SLE病情活動(dòng)性相關(guān);FasL是最重要的死亡因子,SLE異常活化的CD4+、CD8+T細(xì)胞高表達(dá)FasL是SLE T細(xì)胞發(fā)生AICD的關(guān)鍵。Nakajima等曾應(yīng)用FasL單抗治療NZB/WF1小鼠,發(fā)現(xiàn)狼瘡性腎炎的進(jìn)展得到明顯抑制[14,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,體外SLE患者PBMCs的培養(yǎng)中加入FasL抗體可顯著抑制T細(xì)胞亞群凋亡。在機(jī)體的免疫應(yīng)答中,活化的T細(xì)胞發(fā)生AICD是重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制之一:Fas/FasL表達(dá)率的增加可能是SLE T淋巴細(xì)胞異?；罨蟮囊环N結(jié)果,而這直接導(dǎo)致T細(xì)胞發(fā)生AICD。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn),SLE患者血清IL-10水平顯著升高,高水平的IL-10不僅與抗ds-DNA自身抗體增加密切相關(guān),還與T細(xì)胞亞群異常凋亡、CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群平衡失調(diào)密切相關(guān)。Llorente等曾應(yīng)用IL-10中和單抗治療SLE動(dòng)物模型,取得了一定的療效[16,17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,體外SLE患者PBMCs的培養(yǎng)中加入IL-10抗體后,CD4+T細(xì)胞亞群的Fas/FasL高表達(dá)及凋亡異常明顯抑制,CD4+/CD8+比例倒置狀況得到改善。IL-10作為體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)抑制因子,參與刺激自身抗體的產(chǎn)生和抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答。

IL-10對(duì)SLE患者T淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用具體體現(xiàn)在:SLE患者高水平的IL-10參與誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群高表達(dá)Fas/FasL,尤其是CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群高表達(dá)FasL,使Fas表達(dá)顯著增高的CD4+T細(xì)胞亞群發(fā)生AICD,最終導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞比例下降、CD4+/CD8+比值降低、T細(xì)胞免疫功能缺陷,促進(jìn)了SLE疾病的發(fā)展。這在跟蹤實(shí)驗(yàn)中也得到了進(jìn)一步證明,SLE患者經(jīng)治療病情好轉(zhuǎn)、穩(wěn)定時(shí)伴有IL-10水平下降,同時(shí)T細(xì)胞亞群表達(dá)Fas/FasL明顯下降,T細(xì)胞凋亡也逐漸減少,這些變化在CD4+T細(xì)胞亞群中體現(xiàn)得最為明顯。

綜上所述,我們可以初步認(rèn)為:SLE的發(fā)生、發(fā)展及緩解與T細(xì)胞亞群的免疫平衡密切相關(guān)。在免疫抑制因子IL-10的調(diào)節(jié)下,SLE異?；罨腡淋巴細(xì)胞發(fā)生了以Fas/FasL為主要死亡途徑的AICD,這有助于SLE患者細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)。誠(chéng)然,T細(xì)胞的凋亡機(jī)制非常復(fù)雜,涉及Fas/FasL為代表的外源性途徑和Bcl-2為代表的線粒體途徑,還涉及一系列的調(diào)節(jié)基因和影響因子。SLE活化的T細(xì)胞有無(wú)其他途徑的凋亡機(jī)制,IL-10是否還以其他途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,我們將在另文發(fā)表。

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