兔抗B16黑素細(xì)胞多克隆抗體的制備及對黑素細(xì)胞增殖的影響①

陳菊萍 馬 櫻 羅志娟 魏大鵬 (揚(yáng)州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院皮膚性病科,揚(yáng)州 225001)

色素減退性疾病白癜風(fēng)是嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的一種疾病,其發(fā)病機(jī)制目前未完全明了,許多研究表明可能和自身免疫有很大關(guān)系[1-5],但自身免疫是初始原因還是繼發(fā)原因,一直未有定論,也有研究表明和遺傳、自由基對細(xì)胞的損傷等有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過制備兔抗B16黑素細(xì)胞多克隆抗體,利用免疫組織化學(xué)和 Western blot鑒定多克隆抗體;并通過親和層析法純化抗血清,得到IgG,檢測其對黑素細(xì)胞增殖的影響,為進(jìn)一步研究此抗體對黑素細(xì)胞生長及色素代謝的影響奠定基礎(chǔ),從另一方面探討免疫因素特別是自身免疫在色素減退性疾病白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中所起的作用,為尋找白癜風(fēng)的動物模型打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 健康家兔,雄性,體重2 kg,四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動物中心提供。B16黑素細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG,生物素化山羊抗兔IgG等試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 B16黑素細(xì)胞培養(yǎng)、收集、爬片及固定 B16黑素細(xì)胞復(fù)蘇后,使用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的黑素細(xì)胞,接種入6孔板,每孔加入4%多聚甲醛1 ml,固定后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 B16黑素細(xì)胞顆粒性抗原免疫家兔 經(jīng)75%酒精固定后的B16黑素,Hank's液離心清洗細(xì)胞,最后用生理鹽水懸勻成5×107ml-1免疫用B16黑素細(xì)胞混懸液。經(jīng)家兔耳緣靜脈注射B16免疫用黑素細(xì)胞混懸液1.0ml做第一次免疫。第7天同樣方法第二次免疫家兔;第14天家兔耳緣靜脈采血0.5 ml,凝集實(shí)驗(yàn)測血清抗B16黑素細(xì)胞抗體效價(jià)。第14天同樣方法耳緣靜脈注射B16黑素細(xì)胞懸液0.5 ml第三次免疫家兔;第20天家兔耳緣靜脈采血0.5 ml,凝集實(shí)驗(yàn)測血清抗B16黑素細(xì)胞抗體效價(jià)。第20天同樣方法耳緣靜脈注射B16黑素細(xì)胞懸液0.5 ml第四次免疫家兔;以后分別于第23天、25天,第5次、第6次免疫和采血測定抗體效價(jià)。

1.2.3 家兔血清抗B16黑素細(xì)胞抗體效價(jià)測定-試血(試管凝集實(shí)驗(yàn)) 免疫三次(14天)后、四次(20天)后、免疫五次(23天)后,免疫六次(25天)后,試管凝集法分別測家兔血清抗體效價(jià)。具體方法為:分別取家兔耳緣靜脈血、家兔心臟血、頸動脈血經(jīng)靜置,凝固,血清析出,離心,取上層血清稀釋后加入U(xiǎn)型微量反應(yīng)板中,不加血清而加等量生理鹽水(N.S)者作為N.S對照。將B16黑素細(xì)胞懸液加入上述U型微量反應(yīng)板中,37℃孵育45分鐘后觀察結(jié)果。

1.2.4 B16黑素細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)(IHC)—SP法 B16黑素細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定后,用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué),一抗為 1∶200、1∶500、1∶1 000倍稀釋的上述所獲不同免疫次數(shù)后家兔抗B16黑素細(xì)胞全血清。二抗工作液,即生物素化二抗工作液(IgG/Bio)(生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供,即用型),三抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供,即用型)。DAB顯色后鏡檢。

1.2.5 B16黑素細(xì)胞裂解液 Western blot檢測 取變性處理后的B16黑素細(xì)胞裂解液樣品,每泳道加入50 μ l,30 mA恒流SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)N.C膜,5%脫脂奶粉封閉液封閉,分別加入一抗溶液即上述所獲不同免疫次數(shù)后家兔抗B16黑素細(xì)胞全血清(稀釋 1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000倍),二抗工作液即生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供),三抗工作液:PBS-T 1∶1 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液。DAB顯色。檢測結(jié)果。

1.2.6 親和層析法純化兔抗B16黑素細(xì)胞抗血清及蛋白質(zhì)含量的測定

綜上所述，本文研究的結(jié)果為康復(fù)醫(yī)學(xué)工作者在為患者康復(fù)訓(xùn)練時(shí)肘關(guān)節(jié)活動度達(dá)到日常生活所需即為適合的活動角度。使康復(fù)醫(yī)學(xué)工作者在為肘關(guān)節(jié)功能障礙的患者康復(fù)訓(xùn)練時(shí)提供一定的指導(dǎo)。若患者在做某項(xiàng)功能性動作上有困難，則要把評估和治療這個(gè)過程放到康復(fù)訓(xùn)練中來；同樣的，若患者已經(jīng)知道肘關(guān)節(jié)的活動度不足，治療師和康復(fù)醫(yī)師就要預(yù)知患者在做相對的功能性動作時(shí)有困難，并且要建議做適當(dāng)?shù)恼{(diào)試，沒有必要一味的去追求肘關(guān)節(jié)活動度的完全恢復(fù)。

1.2.6.1 抗血清的純化、透析及濃縮 活化載體及偶聯(lián)蛋白:購買時(shí)已經(jīng)完成。利用瓊脂糖珠(Protein G sepharose 4 fast flow)進(jìn)行親和層析。經(jīng)透析、濃縮,收集第一峰非IgG及第二峰IgG。

1.2.6.2 紫外(UV)吸收測定法測定第一峰及第二峰蛋白質(zhì)含量 應(yīng)用752型紫外光柵分光光度儀,選用光程為1 cm的石英比色杯,在280 nm波長處分別測定各管(未純化抗血清,純化第一峰即非IgG,純化第二峰即IgG)溶液的A280值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程,分別求得其蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.7 全血清及非IgG、IgG SDS-PAGE變性/非變性電泳 將樣品1:未純化兔抗B16黑素細(xì)胞抗血清;樣品2:收集第一峰即非 IgG;樣品 3:第二峰(IgG),用于變性電泳;樣品4:第二峰(IgG),用于非變性電泳。處理后按1.2.5的方法上樣及電泳。于1 mg/ml的考馬司亮藍(lán)中染色3小時(shí)。脫色:染色結(jié)束后,取出分離膠置于脫色液中,室溫脫色過夜。觀察結(jié)果。

1.2.8 MTT比色法檢測全血清、非IgG及IgG對B16黑素細(xì)胞增殖的影響 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入全血清、非IgG及IgG,用正常兔IgG和非IgG為對照,再分別加入B16黑素細(xì)胞懸液100 μ l,均為3復(fù)孔,重復(fù)2次。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng) 24、48、72小時(shí)每孔加入 5 mg/ml的MTT 10 μ l,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μ l,輕輕振搖20分鐘,使結(jié)晶盡量完全溶解。ZS-3型板式酶標(biāo)儀測570 nm各孔吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 11.5軟件,用重復(fù)測量方差分析檢驗(yàn),以P＜0.05,有顯著性差異,數(shù)據(jù)使用±s。

2 結(jié)果

2.1 兔抗B16黑素細(xì)胞抗血清效價(jià)檢測結(jié)果 見表1,以B16黑素細(xì)胞懸液作為顆?？乖?jīng)家兔耳靜脈分別免疫14天后,用試管凝集法測抗血清效價(jià)達(dá)1∶80;20天和23天后分別測其效價(jià)高達(dá)1∶1 280,此時(shí)抗B16黑素細(xì)胞多克隆抗體效價(jià)以達(dá)到較高水平,提示可以進(jìn)行抗血清收集。

B16黑素細(xì)胞爬片的免疫組化顯示在兔抗B16黑素細(xì)胞抗血清 1∶200、1∶500、1∶1 000 倍稀釋時(shí),均可見細(xì)胞漿內(nèi)有明顯的棕黃色顆粒,突觸中也可見細(xì)小的陽性顆粒;而陰性對照中胞漿仍未淺藍(lán)色,未出現(xiàn)陽性顆粒,說明免疫所得的抗血清效價(jià)較高,如圖1。

2.3 B16黑素細(xì)胞裂解液 Western blot檢測結(jié)果

選擇兔抗B16黑素細(xì)胞抗血清即一抗稀釋度為1∶500,生物素化二抗稀釋度為1∶1 000,做B16黑素細(xì)胞裂解物的 Western blot檢測。檢測結(jié)果見圖2。圖中可見蛋白條帶較多,說明所制備的抗血清是抗B16黑素細(xì)胞胞漿中多種蛋白成分的多克隆抗體。

2.4 親和層析法純化兔抗B16黑素細(xì)胞抗血清結(jié)果 利用瓊脂糖珠(G protein)親和層析法將兔抗B16黑素細(xì)胞多克隆抗體純化,可見兩個(gè)明顯的吸收峰,第一峰為非IgG雜蛋白吸收峰,第二峰即洗脫峰是純化所得抗體IgG(圖未列出)。

2.5 紫外(UV)吸收測定法測定非IgG及IgG蛋白質(zhì)含量 結(jié)果表明抗血清純化效果較好,濃度均達(dá)到預(yù)期值(數(shù)據(jù)未列出)。

圖1 免疫組化分析抗血清效價(jià)(20×20)Fig.1 Expression of titer antiserum by IHC(20×20)

圖2 Western blot分析B16黑素細(xì)胞胞漿中蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of protein in B16 melanocyte plasma by Western blot

2.6 全血清及非IgG、IgG的SDS-PAGE變性/非變性電泳結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)果顯示全血清即未純化抗血清蛋白條帶較多,包括分子量 116.0、66.2、45.0、35.0、25.0 kD的蛋白條帶;非IgG則主要包括分子量116.0、45.0、35.0 kD的蛋白條帶;變性 IgG包括分子量66.2、35.0、25.0 kD的蛋白條帶,其中66.2 kD處有兩條條帶,非變性IgG在66.2 kD處僅一條條帶(如圖3)。

圖3 全血清及非IgG、IgG的 SDS-PAGE變性/非變性電泳Fig.3 Expression of protein by SDS-PAGE

圖4 MTT法檢測各組分對B16黑素細(xì)胞增殖的影響Fig.4 The effect of composition of antiserum on B16 melanocyte proliferation by MTT

表1 B16黑素細(xì)胞免疫家兔后第14天、第20天、第23天檢測抗血清效價(jià)結(jié)果Tab.1 the titer of the antiserum immuned by B16 melanocytes after 14,20,23 days

2.7 MTT比色法檢測全血清、非IgG和IgG對B16黑素細(xì)胞增殖的影響結(jié)果 用重復(fù)測量方差分析法,得P=0.012＜0.05,IgG組與其余兩組相比,對B16黑素細(xì)胞增殖的影響差異顯著(如圖4)。

3 討論

白癜風(fēng)是一種常見的色素減退性疾病,表現(xiàn)為皮膚或粘膜因?yàn)楹谒丶?xì)胞的缺失而導(dǎo)致的后天性色素減退,其確切的發(fā)病機(jī)制至今未完全清楚,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[6-8],白癜風(fēng)患者中自身免疫性疾病的發(fā)生率明顯高于正常人,白癜風(fēng)患者易合并甲狀腺炎、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斑禿及銀屑病等等與自身免疫有關(guān)的疾病,其血清中存在多種自身抗體和細(xì)胞免疫異?，F(xiàn)象,如IgC、IgA、IgM 均顯著高于正常人,皮損直接免疫熒光檢查可見表皮基底膜有IgG和C3沉積,白癜風(fēng)患者血清中抗黑素細(xì)胞抗體陽性率高達(dá)50%～93%,從白癜風(fēng)的皮損中我們也發(fā)現(xiàn)有T淋巴細(xì)胞的浸潤[9,10],這些都證明白癜風(fēng)與體液免疫和細(xì)胞免疫有關(guān),但免疫異常究竟是初始原因還是繼發(fā)的反應(yīng)一直未有定論。也有學(xué)者進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者的一級親屬中自身免疫性疾病的發(fā)病率明顯高于正常人群,并發(fā)現(xiàn)了一些易感基因[11-13]。近幾年也有學(xué)者認(rèn)為,H2O2及其代謝產(chǎn)物介導(dǎo)了一些抗氧化酶特別是過氧化氫酶、硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、超氧歧化酶等的改變,H2O2介導(dǎo)的氧化使許多蛋白功能喪失,從而引發(fā)色素代謝異常,而H2O2的產(chǎn)生可能與一些免疫異常有關(guān),認(rèn)為免疫異常是初始原因,H2O2的產(chǎn)生是繼發(fā)的[14-20],但是由于缺乏很好的動物模型,白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制至今未完全清楚。

本實(shí)驗(yàn)采用B16黑素細(xì)胞懸液作為顆?？乖?經(jīng)家兔耳緣靜脈注射,使其產(chǎn)生抗B16黑素細(xì)胞的多克隆抗體,即抗血清,并經(jīng)純化得到IgG,觀察IgG對B16黑素細(xì)胞生長及色素代謝的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中,我們利用MTT比色法分別檢測全血清、非IgG、IgG對B16黑素細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明IgG組與其余兩組相比,對B16黑素細(xì)胞生長抑制作用差異顯著,啟發(fā)我們在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí),可以將三組分別注射入小鼠皮膚,從肉眼、免疫組化等多方面觀察皮膚色素的變化,此實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究IgG對黑素細(xì)胞色素代謝的影響、IgG對黑素細(xì)胞細(xì)胞毒試驗(yàn)、誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡、對黑素細(xì)胞酪氨酸酶及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響奠定了基礎(chǔ),進(jìn)一步證明了自身免疫因素在色素減退性疾病白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中起了一定的作用。

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