趙 鑫 王 宏 向軍儉 朱中松 宋其芳 鄧 寧
(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院抗體工程研究中心,廣州 510632)
VEGF作為血管形成和通透性誘導(dǎo)因子[1],其表達(dá)水平與原發(fā)腫瘤的大小、血管生成、淋巴管轉(zhuǎn)移等多種因素成正相關(guān)[2,3],因此已成為抗腫瘤血管新生治療中理想的靶分子之一。
噬菌體表面展示技術(shù)自Smith于1985年首次闡明以來,已得到長足進(jìn)步,被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥及化學(xué)結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域。噬菌體表面展示的融合蛋白與編碼該蛋白的DNA序列直接相關(guān),根據(jù)該DNA序列可自我復(fù)制的特性,能很容易直觀地識別和擴(kuò)增目的蛋白克隆。并且表達(dá)于噬菌體表面的融合蛋白能表現(xiàn)出與其相應(yīng)天然蛋白一樣或相似的功能及特點(diǎn)。本研究通過計(jì)算機(jī)模擬得到一系列VEGF相關(guān)表位序列,用噬菌體展示技術(shù)將其展示于噬菌體表面,檢測這些多肽在抗腫瘤增殖和抗血管新生方面的效用,從而篩選有明顯抗腫瘤、抗血管形成的多肽片段,為抗腫瘤多肽疫苗藥物研發(fā)打下基礎(chǔ)。
1.1 材料 原代HUVEC細(xì)胞由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院高國全教授惠贈,高轉(zhuǎn)移細(xì)胞B16F10購自南京凱基生物有限公司,B16細(xì)胞、pCANTAB5-E、VCSM13、XL1-Blue均系本實(shí)驗(yàn)室保存,RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,M199培養(yǎng)基購自Hyclone公司,小牛血清購自蘭州民海生物有限公司,ECGS、MTT、ECM gel均購自 Sigma公司,Transwell購自Corning公司,T4連接酶購自NEB公司,HindⅢ、NotⅠ以及T載體連接試劑盒購自TaKaRa公司,膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司。
1.2 方法
1.2.1 VEGF表位肽載體pCANTAB5-E的構(gòu)建 根據(jù)pCANTAB5-E載體序列以及人VEGF189基因序列設(shè)計(jì)引物序列(見表1),由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。第一輪PCR體系中加入等體積的P1、P2引物,94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性5分鐘,55℃退火5分鐘,72℃延伸5分鐘,7個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。第二輪PCR則以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,分別加入P3、P4引物各1 μ l,94℃變性40秒,56℃退火 35秒,72℃延伸40秒,30個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR得到目標(biāo)序列。將第二輪 PCR產(chǎn)物切膠回收,連入T載體,轉(zhuǎn)入XL1-Blue菌中,經(jīng)培養(yǎng)挑取單菌落,提取質(zhì)粒并鑒定,行DNA序列分析,檢定序列的正確性。通過HindⅢ和NotⅠ對pCANTAB5-E和VEGF表位肽T載體分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng),37℃水浴酶切16小時(shí)。將載體片段與表位肽片段按摩爾比1∶6,于16℃水浴連接24小時(shí)。將連接后的pCANTAB5-E/VEGF重組載體轉(zhuǎn)化XL1-Blue菌株,經(jīng)培養(yǎng)挑取單克隆,提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
1.2.2 噬菌體展示VEGF表位肽 挑取單個(gè)XL1-Blue菌落,接種到4ml 2×YT培養(yǎng)液中,待培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí) ,取稀釋度為 1011、109、107、105、103、101pfu/ml的 VCSM13 100 μ l,分別與 上述 100 μ l XL1-Blue菌液混合,室溫靜置30分鐘。42℃水浴下,加入融化的2×YT頂層培養(yǎng)基至3ml,吹打混勻,加入無抗性的2×YT底層培養(yǎng)基上,平衡至室溫后37℃培養(yǎng)過夜。取分隔良好的噬斑,加入5 ml呈對數(shù)生長期的XL1-Blue菌液中,37℃,220 r/min培養(yǎng)5小時(shí),經(jīng)12 000 r/min離心5分鐘,收集上清,得到擴(kuò)增的VCSM13,以2×YT培養(yǎng)液稀釋至 10-10和10-12。取各稀釋度的噬菌體 100 μ l,分別與 100 μ l對數(shù)生長期的XL1-Blue菌液混合,37℃培養(yǎng)過夜,調(diào)整噬菌體VCSM13滴度為2.0×1013pfu/ml。取10 μ l轉(zhuǎn)入pCANTAB5-E/VEGF表位肽載體的XL1-Blue菌液,加入4 ml 2×YT培養(yǎng)液(含有50 mg/L Amp)37℃振蕩培養(yǎng)(220 r/min)過夜。取上述菌液1 ml,加入200 ml 2×YT培養(yǎng)液(含有50 mg/L Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)(220 r/min)至OD600nm≈0.6。加入輔助噬菌體1 ml,室溫靜置30分鐘,加入Kan至70 mg/L,37℃振蕩培養(yǎng)(220 r/min)過夜。次日收集菌液,8 000 r/min離心10分鐘,取上清分別加入等體積的飽和硫酸銨,冰浴沉淀3小時(shí)。8 500 r/min離心,收集沉淀,加滅菌DMEM溶解沉淀。測VEGF噬菌體表位肽的滴度為VSB:4.6×1012pfu/ml,VNB:1.1×1012pfu/ml,VEB:1.9×1012pfu/ml,VTB:3.7×1012pfu/ml。
1.2.3 ELISA法檢測噬菌體表位肽 用兔抗人VEGF多抗(9 ng/100 μ l)包被酶標(biāo)板,37℃2小時(shí);常規(guī)洗板3次;加入5%脫脂奶粉(200 μ l/孔),37℃封閉1小時(shí);常規(guī)洗板3次;加入不同稀釋度的噬菌體表位肽,并設(shè)立VCSM13對照、空白對照,100 μ l/孔,37℃,1小時(shí);常規(guī)洗板3次;加入抗噬菌體HRP酶標(biāo)二抗(1∶2 500)100 μ l/孔,37℃,30 分鐘;常規(guī)洗板 5次;加底物顯色液(TMB)100 μ l/孔,避光 10分鐘 ,加 2 mol/L H2SO4(50 μ l/孔)終止反應(yīng),測定各孔OD450 nm值。
1.2.4 VEGF表位肽對內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的原代HUVEC細(xì)胞,以5 000/孔的細(xì)胞數(shù)加入96孔板,用含10%小牛血清的M199培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24小時(shí);換用含0.2%小牛血清的M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)至單層細(xì)胞狀態(tài);加入不同稀釋度的噬菌體表位肽、設(shè)立VCSM13噬菌體對照和空白對照,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí);加入MTT溶液(5 g/L)20 μ l/孔,37℃繼續(xù)孵育3小時(shí),棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清,加入DMSO(150 μ l/孔),振 蕩 10 分鐘,測 定各孔 492 nm吸收值A(chǔ),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。
表1 PCR引物堿基序列Tab.1 Sequences of primers for PCR
1.2.5 VEGF表位肽對內(nèi)皮細(xì)胞成管抑制作用 根據(jù)Levchenko等[4]的研究方法,將 ECM gel置于4℃活化過夜,按1∶1比例與DMEM 混勻后,鋪于 96孔板中(60 μ l/孔),室溫靜置 5分鐘。取原代HUVEC細(xì)胞,以1.5×104/50 μ l的濃度加入鋪好ECM gel的96孔板中。取VEGF表位肽VSB、VNB、VEB、VTB用基本培養(yǎng)基稀釋至1010pfu/ml并設(shè)立空白對照組和同滴度的VCSM13對照組,加入96孔板中,于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時(shí)后觀察拍照(40×)。
1.2.6 VEGF表位肽對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞,以5 000/孔的細(xì)胞數(shù)分別加至96孔板中,用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、含5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí);換用含0.2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)至單層細(xì)胞狀態(tài);加入不同稀釋度的噬菌體表位肽并設(shè)立VCSM13噬菌體對照組和空白對照組,于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí);加入MTT(5 g/L)溶液,20 μ l/孔 ,37℃孵育 3 小時(shí) ,棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清,加入 DMSO(150 μ l/孔),振蕩 10 分鐘,測定各孔492 nm吸收值A(chǔ),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。
1.2.7 VEGF表位肽對腫瘤細(xì)胞遷移抑制作用 根據(jù)Chan等[5]的研究方法,在放入Transwell小室的24孔培養(yǎng)板中,于小室下層加入含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基600 μ l。在小室上層加入濃度為5×105ml-1高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株 B16F10懸液 100 μ l,并相應(yīng)加入VSB、VNB、VEB和VTB噬菌體表位肽(1010pfu/ml),設(shè)立同稀釋度VCSM13對照和空白對照。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)后取出小室,70%乙醇中固定15分鐘,Giemsa染色15分鐘,用棉簽輕輕將小室上層的細(xì)胞擦去、風(fēng)干。顯微鏡下計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率%=用藥組/Control組×100%,并拍照。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 不同用藥組不同濃度的數(shù)據(jù)比較用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),各組數(shù)據(jù)結(jié)果用±s表示,以 P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。
2.1 pCANTAB5-E/VEGF表位載體轉(zhuǎn)入XL1-Blue菌株挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定 為確定插入了VEGF表位肽序列的pCANTAB5-E載體是否順利轉(zhuǎn)入XL1-Blue中并得以表達(dá),從培養(yǎng)板上挑取單克隆小提質(zhì)粒,用HindⅢ 和NotⅠ進(jìn)行雙酶切,行電泳鑒定,如圖1所示,4株表位肽(VSB、VNB、VEB、VTB)片段分布在100~200 bp之間,表明該4株表位肽均被成功構(gòu)建于目的載體上并順利表達(dá)。
2.2 噬菌體展示VEGF表位肽的表達(dá)水平 用兔抗人VEGF多抗經(jīng)ELISA法測定結(jié)果顯示,與相同稀釋度的對照組VCSM13相比,VSB、VNB、VEB、VTB噬菌體表位肽在1/125稀釋度時(shí)與抗VEGF多抗仍有結(jié)合(P<0.05),表明這四株表位肽與抗VEGF多抗發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng),由此可知四株表位肽順利展示于噬菌體表面,見圖2。
圖1 噬菌體表位肽VSB、VNB、VEB、VTB單克隆酶切鑒定Fig.1 Identification of peptides VSB,VNB,VEB,VTB
圖2 噬菌體展示VEGF表位肽 VSB、VNB、VEB、VTB表達(dá)的ELISA鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of expression for peptides of VSB,VNB,VEB,VTB by ELISA
2.3 VEGF噬菌體表位肽對HUVEC細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測VEGF噬菌體表位肽在不同稀釋度條件下對原代HUVEC增殖的抑制情況,OD492nm檢測各孔吸光度A值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,經(jīng)1/10濃度稀釋度的VSB、VNB、VEB、VTB表位肽對HUVEC 細(xì)胞增殖的抑制率超過50%,其中表位肽VNB對HUVEC細(xì)胞增殖的抑制率最高達(dá)到了(64.8±3.3)%(P<0.05),如圖3所示。
圖3 噬菌體表位肽抑制HUVEC細(xì)胞增殖作用Fig.3 Inhibition rate of peptides on HUVEC proliferation
2.4 VEGF噬菌體表位肽對HUVEC細(xì)胞成管作用的影響 ECM gel法檢測VEGF噬菌體表位肽對原代HUVEC成管作用的影響,加表位肽作用5小時(shí)后顯微鏡下觀察拍照(40×),如圖4所示。Control組為空白對照組,原代HUVEC在ECM gel中遷移排列成線形結(jié)構(gòu),并相互交叉成網(wǎng)狀,即形成血管雛形,如圖中箭頭所示。VCSM13對照中也形成了相應(yīng)的線形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而加入表位肽的實(shí)驗(yàn)組中,VSB、VTB組雖然有部分HUVEC排列成線形,但與對照組相比,其線形結(jié)構(gòu)數(shù)量少且沒有形成較為明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),表明這兩株VEGF表位肽對HUVEC細(xì)胞的成管具有明顯的抑制作用。
2.5 VEGF噬菌體表位肽對B16細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測VEGF噬菌體表位肽在不同稀釋度條件下對黑色素瘤細(xì)胞B16增殖的抑制情況,OD492nm檢測各孔吸光度A值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,在1/30濃度稀釋度的VSB、VNB、VEB、VTB表位肽作用下,B16細(xì)胞增殖的抑制率均超過50%。其中,VEB表位肽對B16增殖的抑制率達(dá)到(75.7±6.6)%,VTB表位肽對B16增殖的抑制率也達(dá)到(66.5±6.3)%(P<0.05),如圖5所示。
圖4 噬菌體表位肽抑制HUVEC細(xì)胞成管作用(40×)Fig.4 Inhibition of peptides on tube formation of HUVEC(40×)
圖5 噬菌體表位肽抑制B16腫瘤細(xì)胞增殖作用Fig.5 Inhibition rate of peptides on B16 proliferation
圖6 噬菌體表位肽抑制B16F10細(xì)胞遷移作用Fig.6 Inhibition of peptides on B16F10 migration
圖7 噬菌體表位肽抑制B16F10腫瘤細(xì)胞遷移(100×)Fig.7 Inhibition of peptides on B16F10 migration(100×)
2.6 VEGF噬菌體表位肽對B16F10細(xì)胞遷移的影響 Transwell模型檢測4株表位肽對高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16F10遷移作用的影響,40×鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞遷移率,細(xì)胞遷移率%=用藥組/Control組×100%。結(jié)果表明VEGF的VSB、VNB、VEB、VTB表位肽對高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16F10的遷移有明顯抑制作用,與空白對照組相比,抑制遷移率均超過80%,其中VEB實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率僅為(3.9±0.6)%(P<0.05),如圖6所示。圖7為100×鏡下顯微鏡觀察圖,圖中呈深色細(xì)長菱形結(jié)構(gòu)的為遷移到Transwell小室下層膜上的B16F10細(xì)胞,由圖可知,空白對照組和VCSM13對照組,均有大量B16F10細(xì)胞遷移至小室下層膜上,而用藥組VSB、VNB 、VEB、VTB 中 ,成功遷移至小室下層的B16F10細(xì)胞數(shù)目較少。以上結(jié)果表明這四株表位肽均具有明顯抑制高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16F10遷移的作用。
研究表明,在乳腺癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤等多種腫瘤組織內(nèi)、外都可檢測到大量VEGF及其受體,VEGF在腫瘤組織血管新生方面發(fā)揮著極其重要的作用[6]。因此,抑制VEGF生物學(xué)活性有可能對抑制腫瘤增生、發(fā)展產(chǎn)生巨大影響。近年來與VEGF相關(guān)的腫瘤治療方面取得了不少成果,如抗VEGF單克隆抗體Bevacizumab(商品名Avastatin)、Ranibizumab(商品名Lucentis)已經(jīng)上市;VEGF抑制劑Pegaptanib(商品名Macugen)已獲FDA批準(zhǔn);專門針對肝癌、腎癌和胃腸道癌治療的VEGFR的抑制劑Sorafenib(商品名Nexavar)和Sunitinib(商品名Sutent)也已獲得FDA批準(zhǔn)[7]。然而,這些藥物也有一些缺點(diǎn),如用量大、費(fèi)用高、只能對一種或兩種腫瘤發(fā)揮效用。鑒于此,多肽小分子藥物以其用量少、費(fèi)用低、生物活性強(qiáng)、具有廣譜性的優(yōu)點(diǎn)走進(jìn)了人們視線并逐漸引起專家和學(xué)者的關(guān)注。
多肽類藥物主要包括多肽疫苗、抗腫瘤多肽、多肽導(dǎo)向藥物、細(xì)胞因子模擬肽、抗菌性活性肽、診斷用多肽及其它藥用小肽等七大類。其中,抗腫瘤多肽常用化學(xué)合成或從動物、天然植物中提取獲得,在體內(nèi)外取得抑制腫瘤增殖和血管新生的效果。如Hehir等[8]人工合成的2個(gè)多肽在裸鼠荷瘤模型的研究結(jié)果表明,對人宮頸癌細(xì)胞Hela的抑制率達(dá)到70%,并且都具有抑制血管生成的作用。在細(xì)胞因子及其受體模擬肽的研究方面,學(xué)者們也發(fā)現(xiàn)了一些具有抗腫瘤生長效用的短肽,如Maruta等[9]用人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞篩選得到的與FGFs沒有同源性的保守基序MXXP,合成了7肽MQLPLAT,該短肽能夠與bFGF競爭結(jié)合FGFR,并且能導(dǎo)向到腫瘤組織,發(fā)揮抗腫瘤活性;又如Bae等[10]從合成肽組合文庫中篩選到一種能結(jié)合VEGF的六肽,并能抑制VEGF與受體結(jié)合,阻斷VEGF誘導(dǎo)的雞胚尿囊膜和兔角膜的血管新生,還可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HM7的生長和轉(zhuǎn)移。但這些具有抗腫瘤療效的模擬肽與相關(guān)的人源性細(xì)胞因子同源性并不高。
本研究通過計(jì)算機(jī)模擬出4株VEGF表位多肽,用噬菌體展示技術(shù)獲得。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,這些VEGF同源多肽,在抑制黑色素瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管方面具有較為顯著的作用。特別是VNB(MRCGGCCNDEGLECVPTEE)對HUVEC細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到 64.8%,而VEB(CGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKN)、VTB(KARQLELNERTCRCDK)對B16細(xì)胞增殖抑制率也分別達(dá)到了75.7%和66.5%。Transwell實(shí)驗(yàn)中,4株表位肽抑制高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16F10遷移率均超過80%,這說明,這些表位肽在抗黑色素瘤增殖、遷移以及抗血管新生方面有著巨大的潛力。
有研究發(fā)現(xiàn),部分多肽的抗腫瘤作用在于腫瘤細(xì)胞膜磷脂分布的非對稱性被破壞,造成磷脂酰乙醇胺(PE)與磷脂酰絲氨酸(PS)多出現(xiàn)在細(xì)胞膜外側(cè),于是多肽鏈里的帶正電荷的極性氨基酸與帶負(fù)電荷的PS相互結(jié)合,使得腫瘤細(xì)胞膜外側(cè)聚集了大量多肽片段,其中非極性氨基酸通過疏水作用介入細(xì)胞膜形成膜孔,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因基質(zhì)外流而死亡,從而起到殺死腫瘤細(xì)胞的作用[11,12]。通過分析VSB、VNB、VEB、VTB表位肽氨基酸序列后發(fā)現(xiàn),VEB和VTB分別具有一段連續(xù)的、5個(gè)以上親水性氨基酸的多肽片段,易于聚集在腫瘤細(xì)胞膜周圍,發(fā)揮抗腫瘤作用。在未來研究中,如果能順利解決多肽易于被體內(nèi)蛋白酶水解的問題,這幾株表位模擬肽將會在抗腫瘤治療方面發(fā)揮其巨大作用。此外,通過進(jìn)一步分析這些肽段的氨基酸序列后,可以將其連接在多聚賴氨酸骨架上形成一個(gè)具有獨(dú)特三維空間結(jié)構(gòu)的大分子疫苗,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗VEGF抗體,從而在腫瘤組織中與VEGFR競爭結(jié)合高表達(dá)的VEGF,達(dá)到抗腫瘤的目的。這4株表位多肽還可以與其他細(xì)胞因子如bFGF、PDGF的模擬肽聯(lián)合用藥形成復(fù)合模擬肽,共同作用于腫瘤組織,與細(xì)胞因子競爭結(jié)合腫瘤組織大量表達(dá)的細(xì)胞因子受體等,達(dá)到更強(qiáng)的抗腫瘤目的。
本研究篩選得到的VEGF模擬肽以VEGF和VEGFR相互作用為目標(biāo),探討小分子多肽對抗腫瘤及抗血管新生方面的效用,對腫瘤抑制藥物以及腫瘤導(dǎo)向性藥物的開發(fā)和研究具有十分重要的參考價(jià)值。
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