過氧化物酶體增殖物激活受體γ通路激活對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響

趙樹梅,李虹偉,沈潞華

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)是核受體超家族的一員;被激活后通過與目的基因啟動子或增強(qiáng)子的應(yīng)答元件結(jié)合,啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),合成相關(guān)酶類和蛋白質(zhì),發(fā)揮特定的生物學(xué)效應(yīng)。PPARγ配體可改善胰島素敏感性、保護(hù)胰島β細(xì)胞功能,其合成配體噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinediones,TZDs)在臨床上廣泛用于治療2型糖尿病。數(shù)項研究顯示TZDs還可抑制多種器官纖維化[1,2],保護(hù)器官功能;同時,TZDs還具有廣泛的心血管系統(tǒng)效應(yīng),如降低血壓、抑制動脈粥樣硬化、限制心肌梗死范圍等[3,4]。本研究旨在探討PPARγ激動劑吡格列酮(pioglitazone,Piog)對糖尿病大鼠心肌纖維化和心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠48只,體重(200±20)g。除正常對照組(Ⅰ組,n=16)外,其余32只一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司)60mg/kg。72,120h后兩次測定血糖≥16.7mmol/L定義為1型糖尿病大鼠[5]。模型大鼠分成2組:糖尿病組(Ⅱ組,n=16);糖尿病治療組(Ⅲ組,n=16)。Ⅲ組大鼠成模后每天給予Piog 10mg/kg(生理鹽水稀釋)灌胃,其他2組每天給予等量的生理鹽水灌胃,標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)14周。

1.2 心功能指標(biāo)測定

1.2.1 超聲心動圖 各組大鼠以6%水合氯醛麻醉,行二維、M型超聲心動圖檢查,測定心室舒張末內(nèi)徑(end-diastolic diameter,EDD)、室間(interventricular septum,IVS)隔厚度及射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)。因各組大鼠心臟體積和質(zhì)量相差較大,以上指標(biāo)/心質(zhì)量得到校正值,如EDD-I,IVS-I,進(jìn)行比較。

1.2.2 心室內(nèi)壓測定 麻醉大鼠行右側(cè)頸動脈置管,頭端置入左心室,連接壓力換能器、壓力檢測系統(tǒng),測定心率(heart rate,H R)、左室收縮壓(left ventricle systolic pressure,LVSP)、左室舒張末壓(left ventricle end-diastolic pressure,LVEDP),室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)等指標(biāo),標(biāo)志各組大鼠的心功能狀態(tài)。

1.3 心肌纖維化程度測定

1.3.1 羥脯氨酸測定 堿水解法測定。按試劑盒步驟進(jìn)行。使用堿水解液將心肌組織膠原的一級結(jié)構(gòu)破壞,使蛋白質(zhì)分解成氨基酸;利用氨基酸在氧化劑的作用下產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色,通過分光光度計比色,計算出水解液中羥脯氨酸的含量。

1.3.2 天狼星紅染色 石蠟切片常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水,入1%苦味酸天狼星紅染液1 h;自來水沖洗10 min后,Mayer蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1min,再次自來水沖洗10min。梯度乙醇脫水,二甲苯透明后,以中性樹脂封片。偏振光顯微鏡下觀察膠原分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 14周后大鼠生存率、體質(zhì)量、心質(zhì)量、隨機(jī)血糖及心肌羥脯氨酸含量情況 見表1。

2.2 天狼星紅染色結(jié)果 天狼星紅染色是膠原纖維特異性染色方法,偏振光顯微鏡下可見,Ⅱ組大鼠心肌彌漫性纖維化(Ⅰ型膠原呈紅黃色,Ⅲ型膠原呈綠色),較Ⅰ組明顯增強(qiáng);而Ⅲ組纖維化程度較Ⅱ組有所減輕(圖1)。

表1 糖尿病造模14周后三組大鼠生存率、體質(zhì)量、心質(zhì)量、心肌羥脯氨酸含量及隨機(jī)血糖的比較(n=16)

2.3 心功能指標(biāo)結(jié)果 與Ⅰ組比較,Ⅱ組LVSP明顯降低,LVEDP明顯升高;經(jīng)Piog干預(yù),Ⅲ組LVSP升高,LVEDP降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。超聲結(jié)果顯示,3組EF值、EDD無顯著差異(P＞0.05),但Ⅱ和Ⅲ組發(fā)生了室間隔增厚,IVS均顯著高于Ⅰ組(P＜0.05;表2)。

3 討 論

心肌纖維化是心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量聚積或膠原成分發(fā)生改變,表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞增生,Ⅰ、Ⅲ型膠原合成增加[6],降解減少;非膠原蛋白-纖連蛋白、層連蛋白合成增加[7],細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡、堆積,導(dǎo)致心臟室壁僵硬度增加、舒張功能減退,最終出現(xiàn)收縮功能障礙,發(fā)生心力衰竭;同時研究發(fā)現(xiàn)心肌纖維化還與心律失常、心源性猝死的發(fā)生密切相關(guān)。目前對于心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究還處于探索階段,尚缺乏規(guī)范的診斷、評價方法,以及有效、系統(tǒng)的藥物治療和干預(yù)措施。

本研究以糖尿病大鼠作為模型來探討心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展,以及藥物干預(yù)的影響和可能的機(jī)制。據(jù)文獻(xiàn)資料顯示,糖尿病大鼠成模后3個月尚屬糖尿病早期階段;本研究中成模14周后,Ⅱ組大鼠心質(zhì)量、體質(zhì)量顯著下降;死亡率顯著高于Ⅲ組。PPARγ激動劑為胰島素增敏劑,本研究顯示其對1型糖尿病大鼠血糖水平無明顯影響;Ⅱ、Ⅲ組隨機(jī)血糖均顯著高于Ⅰ組,但Ⅱ、Ⅲ組間血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可除外兩組間血糖差異對心肌纖維化結(jié)果的影響;也可說明Ⅱ組大鼠死亡率高于Ⅲ組與血糖因素?zé)o關(guān)。

羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸,占膠原氨基酸總量的13%,因此羥脯氨酸含量反映了膠原總體水平和組織纖維化的程度。本研究中,Ⅱ組大鼠心肌羥脯氨酸的含量顯著高于Ⅰ組,PPARγ激動劑治療顯著降低羥脯氨酸的含量,抑制心肌纖維化。天狼星紅染色進(jìn)一步證實(shí)了PPARγ激動劑治療可減輕糖尿病心肌纖維化,且發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌的纖維化早期主要發(fā)生在心外膜下及小冠狀動脈周圍。

14周時,糖尿病大鼠心肌已經(jīng)發(fā)生了間質(zhì)纖維化、重塑,超聲心動圖顯示EDD-I與對照組比較無顯著差異,但I(xiàn)VS-I明顯高于對照組。心功能方面,3組大鼠EF無統(tǒng)計學(xué)差異;但是,心室內(nèi)壓測定發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠 LVEDP已經(jīng)顯著升高,LVSP顯著降低;Piog干預(yù)顯著改善了糖尿病大鼠室內(nèi)壓狀況。+dp/dtmax在各組間無顯著差異;-dp/dtmax在Ⅱ組明顯低于Ⅰ組,說明早期糖尿病影響了大鼠心肌舒張功能,但Piog干預(yù)未能改善這一狀況。

心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展存在著復(fù)雜的機(jī)制,與核轉(zhuǎn)錄因子、炎癥因子、促纖維化因子表達(dá)變異有關(guān);筆者以往的研究證實(shí),PPARγ通路激活可抑制心肌成纖維細(xì)胞血管緊張素Ⅱ1型受體的表達(dá)[8],降低腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用而抑制纖維化的程度;而糖尿病組織纖維化恰恰與腎素-血管緊張素過度激活有關(guān)。本研究顯示,PPARγ通路激活可抑制糖尿病心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展,在病程早期即可改善心臟功能。因此,在使用 TZDs藥物治療糖尿病的同時,還可抑制糖尿病心肌重塑。另外,糖尿病導(dǎo)致的心肌纖維化有其特異性因素——糖基化終末產(chǎn)物的生成。已有研究顯示,PPARγ激動劑可降低糖尿病大鼠血管內(nèi)皮糖基化終末產(chǎn)物受體的表達(dá),改善血管功能[9]。因此,PPARγ激動劑對糖尿病心肌纖維化的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

表2 三組大鼠心功能指標(biāo)結(jié)果

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