北京地區(qū)番茄黃化曲葉病毒病的鑒定及防治對(duì)策

周 濤, 師迎春, 陳笑瑜, 范在豐

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.北京市植物保護(hù)站,北京 100029)

番茄黃化曲葉病毒病是危害世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的一種毀滅性病害,分布廣泛,已給熱帶和亞熱帶地區(qū)的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。近年來(lái)該病在我國(guó)由南向北快速擴(kuò)展,浙江、廣東、廣西、上海、江蘇、山東、安徽等地均報(bào)道發(fā)生[1-9],2009年在北京市大興區(qū)發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)典型黃化曲葉癥狀的番茄植株[10]。該病的典型癥狀為葉片變小黃化,卷曲,邊緣亮黃色,節(jié)間縮短,植株矮化,花朵減少,開花延遲,坐果少而小,成熟期果實(shí)轉(zhuǎn)色不正常,且成熟不均勻。該病在番茄生長(zhǎng)各階段均可發(fā)生。苗期發(fā)病,植株嚴(yán)重矮縮,不能開花結(jié)果,造成絕收;植株生長(zhǎng)后期發(fā)病,上部葉片和新芽表現(xiàn)典型黃化卷曲癥狀,坐果急劇減少,果小且畸形,嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)為雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)成員,寄主有番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆、煙草等[11]。傳毒介體為煙粉虱,同時(shí)可經(jīng)嫁接傳播,不能經(jīng)機(jī)械摩擦或種子傳播。煙粉虱在作物和蔬菜以及雜草上發(fā)生十分普遍,為害茄科、葫蘆科、豆科等多種植物。煙粉虱獲毒后終生帶毒,但不經(jīng)卵傳給下一代。在保護(hù)地栽培條件下,煙粉虱在北方能夠安全越冬并周年發(fā)生,成為導(dǎo)致番茄黃化曲葉病快速擴(kuò)展和大流行的重要原因。

北京市保護(hù)地面積達(dá)1.3萬(wàn)hm2,其中番茄是保護(hù)地主栽蔬菜之一。2009年夏天在北京郊區(qū)調(diào)查番茄病毒病時(shí),發(fā)現(xiàn)有些溫室的番茄植株表現(xiàn)典型黃化曲葉癥狀,且煙粉虱發(fā)生嚴(yán)重。采回發(fā)病番茄樣品,提取總DNA經(jīng)PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定為番茄黃化曲葉病毒病。這是該病毒病在北京地區(qū)發(fā)生的首次分子檢測(cè)鑒定報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2009年9-10月在北京郊區(qū)大興、通州、昌平、房山、密云、順義、延慶縣的日光溫室和大棚中采集表現(xiàn)典型植株矮縮、頂部葉片黃化上卷癥狀的番茄葉片樣品,整理后分別存放在4℃冰箱和-20℃冰箱。

1.2 葉片總DNA的提取

利用CTAB方法快速提取番茄葉片總DNA。取0.1g番茄葉片樣品,液氮中充分研磨,轉(zhuǎn)入2mL離心管后,加入65℃預(yù)熱的600μL2%CTAB抽提緩沖液(2%CTAB,200mmol/LTris-HCl,140mmol/LNaCl,40mmol/LEDTA,1%PVP,pH8.0),混勻后于 65 ℃溫育30min,再用 600μL氯仿抽提兩次后,上清液中加入等體積的異丙醇,取沉淀經(jīng) 70%乙醇洗滌,干燥后溶于 TE中,于-20℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定

根據(jù)謝艷等[12]報(bào)道的檢測(cè)粉虱傳雙生病毒的簡(jiǎn)并引 物 PA(5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′)和 PB(5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′)(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=C或G;Y=C或T;R=A或G;B=C,T或G)進(jìn)行PCR,擴(kuò)增雙生病毒基因間隔區(qū)和部分外殼蛋白基因約500bp的特異片段,并進(jìn)行克隆和序列測(cè)定。

建立25μLPCR反應(yīng)體系：番茄葉片總DNA 2 μL,dNTPs(10mmol/μL)0.5 μL,上游引物 PA 、下游引物PB各0.5μL,10×反應(yīng)緩沖液2.5μL,Taq DNA 聚合酶0.25μL(5U/μL),ddH2O18.75μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃變性2min,按下列條件進(jìn)行32個(gè)循環(huán)(94℃變性30s,55℃復(fù)性45s,72℃延伸30s),72℃延伸10min。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,切取約500bp的目標(biāo)條帶,用凝膠回收試劑盒回收純化后,克隆到pMD18-T載體(TaKaRa)。陽(yáng)性克隆經(jīng)驗(yàn)證后送華大基因公司測(cè)序。

1.4 序列分析

利用 NCBI序列比對(duì)工具 BLAST(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序 nucleotideblast比對(duì)分析克隆獲得的序列,根據(jù)相似性明確病毒種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測(cè)

以提取的總DNA為模板,利用粉虱傳雙生病毒通用引物PA/PB進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果是表現(xiàn)典型癥狀的番茄樣品均擴(kuò)增出約500bp的條帶,和TYLCV陽(yáng)性對(duì)照樣品的擴(kuò)增結(jié)果一致(圖1)。共檢測(cè)了25個(gè)番茄樣品,其中21個(gè)樣品帶有雙生病毒,檢出率為84%。結(jié)果表明北京市郊區(qū)種植的番茄已被煙粉虱傳播的雙生病毒侵染危害。

圖1 部分表現(xiàn)癥狀番茄葉片的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 TYLCV北京分離物部分序列分析

將PCR擴(kuò)增得到的約500bp的片段回收,克隆到pMD18-T載體并進(jìn)行序列測(cè)定。利用NCBI網(wǎng)站上BLAST程序nucleotideblast進(jìn)行序列相似性檢索和分析的結(jié)果表明：在檢測(cè)為陽(yáng)性的來(lái)自北京郊區(qū)的番茄樣品DNA中擴(kuò)增得到的雙生病毒基因組部分序列,與番茄黃化曲葉病毒分離物JSNJ1和XH2(Gen-Bank登錄號(hào)分別為FN293161.1,GU111505.1)的序列相似性最高,均為99%,表明北京郊區(qū)溫室種植番茄已被番茄黃化曲葉病毒感染而導(dǎo)致番茄黃化曲葉病的發(fā)生。

3 防治對(duì)策討論

利用PCR方法從北京郊區(qū)7個(gè)區(qū)縣采集的番茄樣品中檢測(cè)到了番茄黃化曲葉病毒,該分離物的部分序列與已登錄GenBank的分離物JSNJ1和XH2(GenBank登錄號(hào)分別為FN293161.1,GU111505.1)的序列相似性最高,均為99%,說(shuō)明番茄黃化曲葉病已經(jīng)在北京局部發(fā)生,這是該病在北京地區(qū)發(fā)生的首次正式報(bào)道。進(jìn)一步的病情、發(fā)生原因和更廣泛的調(diào)查正在進(jìn)行中。

根據(jù)所獲得的北京分離物的序列和比對(duì)結(jié)果,初步判斷北京發(fā)生的番茄黃化曲葉病毒病可能來(lái)自于從我國(guó)南方調(diào)運(yùn)的帶毒番茄幼苗。另外,北京周年從南方調(diào)運(yùn)的大批花卉苗木上也有攜帶病毒和帶毒煙粉虱的可能性。以帶毒幼苗和帶毒煙粉虱為侵染源,經(jīng)煙粉虱取食擴(kuò)散導(dǎo)致番茄黃化曲葉病在北京發(fā)生。近幾年,北京大面積推廣保護(hù)地栽培生產(chǎn)模式,煙粉虱得以在保護(hù)地內(nèi)安全越冬和周年發(fā)生。如不嚴(yán)加防控,可導(dǎo)致該病的快速傳播和大面積流行。

防治病毒病最有效的方法是培育、種植抗病品種,而目前我國(guó)生產(chǎn)上推廣的番茄品種都不抗該病毒病。國(guó)外有些品種具有高抗特性,又不適合中國(guó)人的口味。因此,從長(zhǎng)期來(lái)考慮務(wù)必要培育符合中國(guó)人口味的抗病品種。短期內(nèi)防治的關(guān)鍵是加強(qiáng)田間栽培管理措施和防治煙粉虱。具體可以參考以下措施：

(1)培育無(wú)蟲無(wú)病幼苗

由于苗期感病后,不僅造成發(fā)病植株絕收,且成為植株間快速傳播的毒源,所以務(wù)必培育無(wú)粉虱無(wú)病毒病的番茄幼苗。育苗床應(yīng)與生產(chǎn)大田分開,苗床盡量選用近年來(lái)未種過(guò)茄科和葫蘆科作物的土壤,對(duì)育苗基質(zhì)及苗床土壤進(jìn)行消毒處理,以減少蟲源;采用40～60目防蟲網(wǎng)隔離育苗以避免苗期感染病毒;苗床內(nèi)在植株頂端高度下5cm懸掛黃色黏蟲膠板,誘殺煙粉虱以減少傳毒媒介。移栽前7d棚室殺蟲處理。

對(duì)外地調(diào)運(yùn)的幼苗,特別是從發(fā)病區(qū)調(diào)運(yùn)的幼苗,務(wù)必在調(diào)運(yùn)前委托具有病毒檢測(cè)能力的大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行抽樣快速檢測(cè),若幼苗中檢測(cè)到該病毒,建議不要調(diào)運(yùn)。

(2)強(qiáng)化田間防控措施

幼苗移栽前全棚內(nèi)殺蟲處理,棚室所有通風(fēng)處均使用40～60目防蟲網(wǎng)覆蓋,門口設(shè)置緩沖門道,內(nèi)外門錯(cuò)開并且避免同時(shí)開啟。以防帶毒的煙粉虱進(jìn)入棚室內(nèi)。

發(fā)現(xiàn)病株或疑似病株,務(wù)必及時(shí)拔除深埋(＞40cm)。及時(shí)清除田間雜草和殘枝落葉減少蟲源和毒源。發(fā)病初期,癥狀可能與缺素癥、普通花葉病毒病相混淆而引起更嚴(yán)重的損失,務(wù)請(qǐng)及時(shí)與當(dāng)?shù)刂脖２块T聯(lián)系。

促進(jìn)番茄植株健壯生長(zhǎng),增施磷鉀肥,保持田間濕潤(rùn),肥水管理要少量多次,提高植株耐病能力。適當(dāng)調(diào)整種植時(shí)間,由于煙粉虱在早春4～5月份從溫室遷飛到露地為害,秋季9～10月份從露地遷回溫室越冬為害,因此調(diào)整幼苗移栽時(shí)間以避免苗期染毒,減輕病害發(fā)生。

由于煙粉虱繁殖能力強(qiáng),擴(kuò)散迅速,具有突發(fā)性、爆發(fā)性和毀滅性為害等特點(diǎn),建議植保部門在集中連片種植番茄和相關(guān)茄科、葫蘆科和豆科作物的地區(qū)進(jìn)行統(tǒng)防統(tǒng)治,減少發(fā)病和未發(fā)病田塊之間的煙粉虱近距離傳播從而提高防治效果。冬季或春季種植番茄,氣溫較低,煙粉虱發(fā)生少,活動(dòng)性不強(qiáng),是控制該病傳播和徹底防治煙粉虱的最佳季節(jié)。

生產(chǎn)中如遇蟲口上升迅速需及時(shí)采用藥劑應(yīng)急防治,可選用25%噻蟲嗪水分散粒劑5000～6000倍液噴霧或25%噻嗪酮可濕性粉劑1500倍與2.5%聯(lián)苯菊酯乳油3000倍混合噴霧。噴藥時(shí)務(wù)必均勻噴到葉片正面和背面,特別著重對(duì)葉片背面噴藥。因煙粉虱繁殖力強(qiáng),極易產(chǎn)生抗藥性,需要幾種藥劑交替混配使用。氣溫較高或保護(hù)地內(nèi)溫度較高時(shí),煙粉虱活動(dòng)活躍,一般5～7d噴藥1次,溫度較低時(shí)可10～15d防治1次。

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