西藏八角蓮葉斑病鑒定及其生物學(xué)特性研究

張格杰, 何建清, 岳海梅

(西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,林芝 860000)

西藏八角蓮Dysosma sayuensis Ying)屬小檗科八角蓮屬,是我國特有多年生草本植物。近年的研究表明其活性成分對(duì)治療食道癌、子宮癌有特效,而且花和葉較美麗,可供觀賞,第一批國家珍稀瀕危保護(hù)植物名錄將其列為三級(jí)保護(hù)植物[1]。

西藏八角蓮葉斑病是藏東南近年發(fā)生的一種新病害,病情發(fā)展迅速,危害逐年加重,已擴(kuò)展蔓延到周邊縣區(qū)藥材種植基地。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)八角蓮屬及其近緣屬植物的系統(tǒng)學(xué)、解剖學(xué)、植物化學(xué)和藥理學(xué)等方面,已有一系列的研究報(bào)道[2-7],但尚未見關(guān)于八角蓮葉斑病的系統(tǒng)報(bào)道,對(duì)其發(fā)生、流行規(guī)律、病原種類及生物學(xué)特性尚不清楚,防治較為困難。為了盡快明確上述問題,制訂出一套符合當(dāng)?shù)厍闆r的病害防治措施,作者于2007-2008年對(duì)該病害進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

在八角蓮葉斑病的發(fā)生期(4-10月),隨機(jī)調(diào)查八角蓮葉片100片,統(tǒng)計(jì)病葉率,并記載葉片病斑數(shù)。

1.2 癥狀觀察

2007年4-10月和2008年4-10月在西藏農(nóng)牧學(xué)院八角蓮種植基地定點(diǎn)、定株、定時(shí)對(duì)八角蓮葉斑病進(jìn)行系統(tǒng)觀察,詳細(xì)記載和描述從顯癥到病害停止發(fā)生各個(gè)時(shí)期的癥狀特點(diǎn),并采集標(biāo)本于室內(nèi)進(jìn)行病原分離,觀察其形態(tài)特征。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 自然發(fā)病組織上病菌觀察

從八角蓮自然發(fā)病葉片、果實(shí)和莖上取病菌鏡檢,或取病組織保濕培養(yǎng)鏡檢,觀察描述病菌形態(tài),并測(cè)量其大小。

1.3.2 分離培養(yǎng)

從八角蓮病葉上取病健交界處的組織,剪成約0.5cm2大小,在70%乙醇中浸5s,0.1%升汞中浸1min,滅菌水洗3次,置PDA培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng),待長出菌絲后,取菌落邊緣菌絲置PDA培養(yǎng)基中心培養(yǎng)。

1.4 致病性測(cè)定

在自然條件下,用直徑為4mm菌碟對(duì)健康八角蓮葉片進(jìn)行有傷與無傷定位接種,以清水瓊脂為對(duì)照,重復(fù)3次,每重復(fù)接種 20片葉,保濕 48h,每2d觀察一次癥狀。發(fā)病后取葉部病斑再分離。

1.5 病原菌生物學(xué)特性研究

1.5.1 不同碳源對(duì)菌絲生長速率的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為查氏(Czapek)培養(yǎng)基,其中碳源蔗糖分別用等質(zhì)量碳的葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、果糖、淀粉、山梨醇、半乳糖、木糖等替換,以無碳培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.5.2 不同氮源對(duì)菌絲生長速率的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基,其中硝酸鈉分別用等質(zhì)量氮的硝酸鉀、硝酸鈉、酪氨酸、天門冬酰胺、硝酸銨、牛肉膏、精氨酸、蛋白胨、硫酸銨等氮源替代,以無氮源培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.5.3 溫度對(duì)菌絲生長的影響

將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上,于 5、10、15、20、25、30、35 ℃和40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5d后測(cè)量菌落直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5.4 pH對(duì)菌絲生長的影響

培養(yǎng)基滅菌后,分別調(diào)節(jié)pH 為2 、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,接菌后于 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5d后測(cè)量菌落直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5.5 光照條件對(duì)菌絲生長的影響

將菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中央,置于完全黑暗、黑暗和光照各12h、完全光照下,放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5d后測(cè)量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查

八角蓮葉斑病始發(fā)于4月下旬,7月進(jìn)入盛發(fā)期。2007年,在林芝發(fā)生危害嚴(yán)重,病葉率90%左右,葉片病斑最多達(dá)187個(gè),造成八角蓮葉片大量枯黃。在7-8月份連續(xù)陰雨時(shí),20d內(nèi)引起該病流行,造成大量八角蓮死亡。

2.2 癥狀

八角蓮葉斑病主要危害八角蓮葉片,也危害葉柄和果實(shí)(圖1a、b)。葉片染病初期出現(xiàn)針尖大小的褪綠斑點(diǎn),然后向四周擴(kuò)散,后期形成邊緣紅褐色、中央黃褐色或褐色的病斑。病斑近圓形或不規(guī)則形,輪廓不清(圖1a)。病斑大小2～6mm。遇高溫低濕天氣,病斑易穿孔。發(fā)病后期枯死葉面生有黑色小點(diǎn)(即分生孢子器圖1c)。

2.3 致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果顯示,八角蓮葉片有傷和無傷均產(chǎn)生典型病斑。接種菌碟后2d,菌碟周圍出現(xiàn)褪色,接種后4d,病斑范圍繼續(xù)擴(kuò)大,同時(shí)病斑呈現(xiàn)紅褐色,接種后6d,病斑上產(chǎn)生小黑點(diǎn),即病菌的分生孢子器。

2.4 病原菌鑒定

菌落圓形,邊緣不整齊,初期邊緣白色,后變墨綠色,最后變深灰色至黑色。菌絲發(fā)達(dá),在培養(yǎng)基上,形成一層似棉絮狀的白色至灰色菌絲(圖1d)。分生孢子器葉面生,散生,初埋生,后突破表皮,孔口外露,居中,近球形或扁球形,胞壁加厚 ,暗褐色,直徑 45～ 65 μm,高 40～ 55 μm;器壁膜質(zhì),褐色,由數(shù)層細(xì)胞組成,壁厚 2.8～4.5μm,內(nèi)壁無色,形成產(chǎn)孢細(xì)胞,上生分生孢子(圖 1e);分生孢子針形,無色,基部鈍圓,頂端尖,直或彎曲,無隔膜,分生孢子大小為(19～35)μm×(1～1.5)μm(圖 1f)。根據(jù)對(duì)病原菌形態(tài)特征觀察、致病性測(cè)定及病原菌生物學(xué)特性初步研究,按文獻(xiàn)[8]將病原菌鑒定為半知菌亞門,腔孢綱,球殼孢目,球殼孢科,殼針孢屬(Septoria sp.)真菌。

圖1 西藏八角蓮葉斑病癥狀及顯微特征

2.5 病原菌生物學(xué)特性

2.5.1 不同碳源、氮源對(duì)病菌菌絲生長速率的影響

碳源對(duì)八角蓮殼針孢菌絲生長速率的影響見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明,八角蓮殼針孢菌對(duì)不同碳源的利用程度有顯著差異,八角蓮殼針孢菌在含碳源與不含碳源的培養(yǎng)基上均可生長,在以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長最快,病菌生長速率為9.3mm/d,以木糖為碳源時(shí),病菌的菌絲生長速率較慢,病菌生長速率為6.8mm/d。八角蓮殼針孢菌在以山梨醇、甘露醇2種供試碳源培養(yǎng)基上的菌絲生長速率均與無碳源對(duì)照無差異,但在菌絲量上存在顯著差異,無碳源對(duì)照菌落稀薄。

氮源測(cè)定結(jié)果顯示,以蛋白胨為氮源時(shí),八角蓮殼針孢菌菌絲生長良好,生長速率快,病菌生長速率為10mm/d;以硝酸銨、硫酸銨為氮源時(shí),菌絲生長較慢,病菌生長速率在 6mm/d以下。試驗(yàn)中觀察到,無氮對(duì)照的菌絲生長速率也較快,但菌絲稀疏。

2.5.2 溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響

溫度對(duì)病原菌的生長具有顯著的影響,菌絲在10～35℃范圍內(nèi)均能擴(kuò)展,20～30℃是菌絲生長的最適宜溫度。低于10℃或高于35℃均不利于病原菌菌絲的生長(表2)。2.5.3 pH對(duì)菌絲生長的影響

表1 不同碳源、氮源對(duì)八角蓮葉斑病病菌菌絲生長速率的影響

表2 溫度對(duì)八角蓮葉斑病病菌菌絲生長的影響

菌落生長的pH范圍為2～12,pH小于2或大于12菌落均不能生長。pH為7～9時(shí),菌落生長速度最快,為該菌最適宜生長的pH范圍。

2.5.4 光照條件對(duì)菌絲生長的影響

3種處理中黑暗條件下最有利于菌絲生長,光照對(duì)菌絲生長有一定的抑制作用,但差異不明顯。

3 結(jié)論與討論

目前,國內(nèi)外還沒有八角蓮葉斑病病原的報(bào)道。經(jīng)病原菌的形態(tài)特征觀察、致病性測(cè)定、培養(yǎng)性狀研究,作者將其病原菌鑒定為半知菌亞門殼針孢屬(Septoriasp.)真菌,為八角蓮新病害。

病原菌生物學(xué)特性測(cè)定表明,在碳源利用方面,以山梨醇最好,木糖最差;在氮源利用方面,以蛋白胨最佳,硫酸銨最差,雖然菌絲在不加碳或氮源的對(duì)照培養(yǎng)基上長得較快,但菌絲長勢(shì)稀薄,總生物量較少;菌絲生長的適宜溫度范圍為20～30℃,在10～35℃范圍內(nèi)菌絲均能生長;病菌適宜的pH范圍為7～9;光照對(duì)菌絲生長影響不明顯。

八角蓮葉斑病屬新病害,目前尚未見有關(guān)發(fā)病、流行規(guī)律及防治技術(shù)的系統(tǒng)研究報(bào)道,病害侵染過程及侵染循環(huán)不詳,應(yīng)盡快開展相關(guān)研究。

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