UV－B輻射增強對鏈格孢菌（Alternaria alternata）生長、生理及致病力的影響

馮 源， 祖艷群， 陳海燕， 李 元

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

在過去30多年間，隨著工業(yè)的發(fā)展，大量氯氟烴類合成物、氮氧化合物等向大氣逸散，致使平流層中臭氧層的破壞不斷加速，導(dǎo)致到達地表的UV－B輻射（280～320nm）顯著增加［1］。雖然 UV－B輻射在太陽短波輻射中所占量較小，但卻能有效地被一些生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸收，從而對生物造成傷害。UV－B輻射不僅對植物、動物及人類產(chǎn)生顯著影響，也會導(dǎo)致微生物數(shù)量和生命活動發(fā)生明顯變化。UV－B輻射可影響植物病原菌的生長發(fā)育、生理生化特性，導(dǎo)致植物病原菌對植物的致病力發(fā)生改變，從而間接影響植物病害嚴重度及病害循環(huán)過程［2］。UV－B輻射增強對植物病菌生長、生理及致病力等方面的顯著影響已在煙草苷菌（Plectosporiumalismatis）［3］、西瓜炭疽病菌（Colletotrichumorbiculare）［4］等病菌的研究中得到證實。而且，同植物一樣，病菌也表現(xiàn)出不同的UV敏感性差異［5］。

燈盞花［Erigeronbreviscapus（Vant.）Hand.－Mazz.］是菊科飛蓬屬多年生草本植物，以全草入藥，具有散寒解表、活血舒筋、止痛、消積等功效［6］。近年來，隨著大面積的人工栽培，燈盞花葉斑病日益嚴重。對云南省幾個主要的燈盞花栽培區(qū)進行調(diào)查結(jié)果表明，鏈格孢菌［Alternariaalternata（Fr.）Keissler］為燈盞花葉斑病的致病菌［7］。目前，國內(nèi)外對于鏈格孢菌的研究報道較多，多偏重于分類和系統(tǒng)發(fā)育研 究［8－9］，有的已深 入 到 分子水平［10－11］，而對于鏈格孢菌的UV光生物學(xué)研究較少。本文首次將環(huán)境因子UV－B輻射與燈盞花葉斑病致病菌——鏈格孢菌相聯(lián)系，研究UV－B輻射增強對該菌生長、生理及致病力的影響，初步探討鏈格孢菌對UV－B輻射增強的響應(yīng)機制，為燈盞花綠色無污染防病技術(shù)的完善與發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

2007－2008年的6－9月，在云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司的燈盞花繁育基地進行燈盞花葉斑病的病情調(diào)查。同時，采集受害植株樣本，于實驗室內(nèi)進行病原真菌的分離、純化及種類鑒定。根據(jù)病菌的形態(tài)特征及柯赫氏法則的致病性檢驗，并參照《真菌鑒定手冊》［12］與《中國真菌志第十六卷鏈格孢屬》［13］，確 定 其 為 鏈 格 孢 菌 ［Alternariaalternata（Fr.）Keissler］。

1.2 UV－B輻射處理

模擬UV－B輻射使用40WUV－B燈管（280～320nm，上海），燈管用0.08mm乙酸纖維素膜包被，以去除小于290nm的短波輻射。用紫外輻射儀（北京師范大學(xué)光電儀器廠生產(chǎn)）測定UV－B輻射強度。設(shè)3個 UV－B輻射水平：0、5.0、10.0kJ／m2；3個 UV－B輻射處理時間：0、40、60min。根據(jù)培養(yǎng)皿與燈管之間的高度調(diào)節(jié)UV－B輻射強度。每處理5個重復(fù)。

用滅菌打孔器（d＝6mm）在已活化的鏈格孢菌菌落邊緣打取菌餅，接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中央，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。之后，將敞開蓋的培養(yǎng)皿置于UV－B燈管正下方，對鏈格孢菌進行UV－B輻射處理。輻射前，預(yù)開紫外燈30min，使其穩(wěn)定。用滅菌打孔器（d＝6mm）從經(jīng)UV－B輻射處理過的菌落上打取菌餅，接入PDA培養(yǎng)基中央，用黑布包裹培養(yǎng)皿防止光復(fù)活，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。

1.3 菌絲生長率測定與形態(tài)觀察

分別在UV－B輻射后培養(yǎng)第1、3、5、7天按照十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長率（%），并記錄菌落形態(tài)變化。挑取培養(yǎng)7d的鏈格孢菌菌絲，于干凈的載玻片上，加蒸餾水用蓋玻片蓋緊，于40倍顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.4 產(chǎn)孢量測定

用血球計數(shù)法［14］測定經(jīng)UV－B輻射處理后培養(yǎng)7d的鏈格孢菌的產(chǎn)孢量。產(chǎn)孢量標準如下：100～102個／mL為稀少、103～105個／mL為中等、106～108個／mL為豐富，分別以“＋、＋＋、＋＋＋”表示。

1.5 菌絲干重測定

用滅菌打孔器（d＝6mm）從經(jīng)UV－B輻射處理過的菌落上打取菌餅，每個100mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中放入1塊菌餅，置于25℃，140r／min條件下，每日定時振蕩3次，每次2h，避光培養(yǎng)。培養(yǎng)7d后，培養(yǎng)液用已知重量的干燥定量濾紙過濾，最后于（80±2）℃烘干，測定菌落干重。同時，分別在培養(yǎng)后第1、3、5、7天取培養(yǎng)液，用2層無菌紗布過濾。濾液在3 000r／min離心20min，取上清液即粗酶液，置于4℃冰箱中保存，進行酶活測定。

1.6 纖維素酶活性測定

參考Abu－Sarra［15］的測定方法。以葡萄糖為材料繪制標準曲線（y＝0.989 5x＋0.027，R2＝0.989 6）。反應(yīng)體系包括0.5mL粗酶液和1.5mL的0.05mol／L檸檬酸緩沖液（含有0.5%羧甲基纖維素鈉，pH＝4.8），50℃下反應(yīng)30min后，立即加入1.5mL二硝基水楊酸試劑（DNS）。反應(yīng)液置于沸水浴中反應(yīng)5min，冷卻后加0.5mL去離子水，在540nm波長處測定吸光值。根據(jù)葡萄糖標準曲線計算生成的還原糖濃度。以上述反應(yīng)條件下1min生成1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位（U），用U／mg·min表示。

1.7 過氧化氫酶（CAT）活性測定

參考 Aebi的測定方法［16］，反應(yīng)液體系包括30μL粗酶液、1.5mL 10mmol／L 磷酸緩沖溶液（pH＝7.6）和1mL 20mmol／L H2O2，在240nm波長處測定吸光值。以上述反應(yīng)條件下每min吸光值變化0.1為一個酶活單位（U），用 U／mg·min表示。

1.8 可溶性蛋白含量測定

參考Bardford［17］的測定方法。以牛血清白蛋白為材料繪制標準曲線（y＝0.434 5x－0.014 3，R2＝0.997）。反應(yīng)體系包括0.5mL粗酶液和5mL考馬斯亮藍G－250蛋白質(zhì)染色液，反應(yīng)15min后，在595nm波長處測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白質(zhì)含量（mg／mL）。

1.9 致病力測定

接種材料為云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司燈盞花繁育基地的燈盞花栽培品種。挑選具10～15片真葉、長勢一致、健壯的燈盞花苗進行接種試驗。用滅菌打孔器（d＝6mm）在UV－B輻射處理后的鏈格孢菌菌落上打取菌餅，貼附在燈盞花的葉片中央。每片葉接種1塊菌餅，每株接種8片葉。每處理3個重復(fù)，每重復(fù)測定10株。植株接種后置于25℃下，套袋保濕培養(yǎng)24h。之后，除去保濕袋，繼續(xù)培養(yǎng)7d后測定病斑直徑。

燈盞花葉斑病分級標準參考小麥鏈格孢葉枯病的病害分級［18］：0級，無癥狀；1級，病斑直徑≤2mm；2級，病斑直徑2.1～4mm；3級，病斑直徑4.1～7mm；4級，病斑直徑7.1～11mm；5級，病斑直徑11mm以上。

1.10 統(tǒng)計分析

采用SPSS11.0軟件，進行顯著性差異分析（Duncan 檢 驗，p＜0.05）。 利 用 Excel（Office 2003）軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢菌菌落及菌絲形態(tài)的變化

經(jīng)不同UV－B輻射處理過的鏈格孢菌在7d后的菌落形態(tài)變化見圖1。經(jīng)UV－B輻射增強處理的鏈格孢菌菌絲分布變得致密、緊湊；氣生菌絲大量減少；黑色素增多，菌落顏色加深，逐漸變?yōu)楹诤稚?；菌落變薄?/p>

圖1 經(jīng)不同UV－B輻射處理的鏈格孢菌菌落形態(tài)變化

UV－B輻射增強對鏈格孢菌的菌絲形態(tài)可產(chǎn)生顯著影響。如圖2b所示，經(jīng)UV－B輻射處理后的鏈格孢菌菌絲內(nèi)顆粒狀沉積物質(zhì)增多，菌絲體變粗，顏色加深，菌絲表面凸凹不平，呈結(jié)節(jié)狀。而正常生長的菌絲均勻透明，呈珊瑚狀，細長而平滑（圖2a）。

圖2 UV－B輻射增強對鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響（40×）

2.2 鏈格孢菌菌絲生長率的變化

表1顯示經(jīng)UV－B輻射處理后1～7d內(nèi)鏈格孢菌的菌絲生長變化。UV－B輻射增強導(dǎo)致菌絲生長明顯滯后，對照組病菌的菌絲生長率最大值出現(xiàn)在輻射后培養(yǎng)第5天，而經(jīng)UV－B輻射處理過的病菌菌絲生長率峰值出現(xiàn)在輻射后培養(yǎng)第7天。經(jīng)UV－B輻射處理后1～5d內(nèi)，隨UV－B輻射增強，菌絲生長率顯著下降（p＜0.05）。在UV－B輻射后培養(yǎng)第7天，5.0kJ／m2輻射強度處理過的鏈格孢菌的菌落直徑同對照之間沒有顯著差異（p＞0.05），而高強度的 UV－B輻射（10.0kJ／m2）處理后的病菌菌落直徑則顯著下降（p＜0.05）。同一UV－B輻射強度下，20～60min的輻射時間對菌絲生長的影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。

表1 UV－B輻射對鏈格孢菌菌絲生長率的影響1）

2.3 鏈格孢菌菌絲干重與產(chǎn)孢量的變化

由表2可知，隨UV－B輻射強度的增加，鏈格孢菌的菌絲干重顯著增加（p＜0.05）；病菌產(chǎn)孢量明顯下降。同一UV－B輻射強度下，20～60min的處理時間對鏈格孢菌菌絲干重與產(chǎn)孢量的影響沒有顯著差異（p＞0.05）。

2.4 鏈格孢菌纖維素酶活性的變化

在UV－B輻射增強條件下，病菌纖維素酶活性顯著下降（p＜0.05）（表3）。隨處理后培養(yǎng)時間的延長，病菌纖維素酶活性逐漸升高。在處理后培養(yǎng)第7天，5.0kJ／m2強度處理過的鏈格孢菌纖維素酶活性同對照之間沒有顯著差異（p＞0.05），經(jīng)10.0kJ／m2強度處理過的病菌酶活顯著降低（p＜0.05）。同一UV－B輻射強度下，經(jīng)20～60min的輻射處理，病菌酶活沒有顯著變化（p＞0.05）。

表2 UV－B輻射對鏈格孢菌菌絲干重與產(chǎn)孢量的影響1，2）

表3 UV－B輻射對鏈格孢菌纖維素酶活性的影響1）

2.5 鏈格孢菌過氧化氫酶（CAT）活性的變化

鏈格孢菌CAT活性表現(xiàn)出與纖維素酶活性不一致的UV－B輻射增強響應(yīng)（表4）。隨UV－B輻射強度的增加，病菌CAT活性顯著升高（p＜0.05）。隨處理后培養(yǎng)時間的延長，病菌CAT活性表現(xiàn)出先上升后下降的變化規(guī)律，對照組酶活則持續(xù)升高。經(jīng)10.0kJ／m2強度處理的病菌酶活高峰出現(xiàn)在處理后第3天；經(jīng)5.0kJ／m2強度處理的鏈格孢菌CAT活性高峰出現(xiàn)處理后第5天。在處理后第7天，鏈格孢菌的CAT活性與對照之間沒有顯著差異（p＞0.05）。同一UV－B輻射強度下，20～60min的輻射處理對鏈格孢菌的CAT活性沒有顯著影響（p＞0.05）。

表4 UV－B輻射對鏈格孢菌CAT活性的影響1）

2.6 鏈格孢菌可溶性蛋白含量的變化

如表5所示，UV－B輻射增強條件下，鏈格孢菌可溶性蛋白含量顯著降低（p＜0.05）。隨處理后培養(yǎng)時間的延長，病菌可溶性蛋白含量逐漸升高，但始終低于對照水平（p＜0.05）。在處理后培養(yǎng)第5天，5.0kJ／m2與10.0kJ／m2輻射強度處理后的病菌可溶性蛋白含量之間沒有顯著差異（p＞0.05）。同一 UV－B輻射強度下，經(jīng)20～60min的輻射處理，鏈格孢菌的可溶性蛋白含量未發(fā)生顯著變化（p＞0.05）。

表5 UV－B輻射對鏈格孢菌可溶性蛋白含量的影響1）

2.7 鏈格孢菌致病力的變化

用經(jīng)UV－B輻射增強處理過的鏈格孢菌進行人工接種試驗，結(jié)果表明，燈盞花葉斑病的病情指數(shù)隨UV－B輻射增強而顯著下降（p＜0.05）（圖3）。這表明UV－B輻射增強導(dǎo)致鏈格孢菌的致病力顯著下降。同一UV－B輻射強度下，對鏈格孢菌進行20～60min的輻射處理，對病菌的致病力沒有顯著影響（p＞0.05）。

圖3 UV－B輻射增強對燈盞花葉斑病病情指數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 UV－B輻射增強對鏈格孢菌生長、生理及致病力的影響及機理

本試驗發(fā)現(xiàn)，UV－B輻射增強可延緩鏈格孢菌的菌絲生長，導(dǎo)致病菌菌落及菌絲形態(tài)顯著改變，菌落直徑及產(chǎn)孢量顯著下降。在對番茄早疫病菌（Alternariasolani）［19］、禾旋孢腔菌（Cochliobolussativus）［20］等病菌的研究中也得到了相似的結(jié)論。鏈格孢菌的纖維素酶活性、CAT活性及可溶性蛋白含量均產(chǎn)生不同程度的UV－B輻射增強響應(yīng)。UV－B輻射對病菌生理生化特性的影響是導(dǎo)致其生長發(fā)生顯著變化的主要原因之一［21］。纖維素酶是植物病菌重要的胞壁降解酶之一，鏈格孢菌纖維素酶活力的減弱也會對病菌的致病力產(chǎn)生顯著的影響。鏈格孢菌CAT活性的變化是UV－B輻射下活性氧積累所致，鏈格孢菌的UV－B輻射損傷可能與活性氧引起的氧化脅迫有關(guān)［22］。紫外線作為誘變劑主要對生物大分子DNA產(chǎn)生誘變作用，造成基因突變，這必然影響蛋白質(zhì)的合成，引起蛋白質(zhì)含量的變化［21］。UV－B輻射增強對鏈格孢菌的生長及生理的損害作用是導(dǎo)致病菌致病力顯著下降的主要原因。

病菌對UV－B輻射的響應(yīng)同時受UV－B輻射強度與輻射時間兩因素的影響，相同波長的UV－B作用效應(yīng)主要取決于其劑量率（單位時間內(nèi)的UV－B輻射強度）［22］。UV－B輻射對病菌的作用具有一定的累積效應(yīng)，只有當劑量率達到或超過一定的閾值，UV－B輻射對鏈格孢菌的損傷效應(yīng)才表現(xiàn)出顯著的變化。而且，這也同鏈格孢菌自身的UV－B敏感性有關(guān)［2］。

3.2 鏈格孢菌對UV－B輻射增強的響應(yīng)機制

鏈格孢菌采取形態(tài)學(xué)上的變化來抵御UV－B輻射增強的傷害。病菌通過改變菌落面積與菌絲密度，促進菌絲內(nèi)顆粒狀沉積物的分泌，增加菌絲干重，來調(diào)節(jié) UV－B輻射對其的穿透力［22－23］。在逆境中，黑色素化的細胞壁層是病菌與環(huán)境間的一道屏障。病菌通過在體內(nèi)合成大量黑色素來有效地吸收紫外光，將光能量轉(zhuǎn)移到其分子結(jié)構(gòu)中，使細胞免受紫外光的傷害［24］。UV輻射主要通過促進黑色素合成基因的表達與轉(zhuǎn)錄，來調(diào)控病菌體內(nèi)黑色素的合成［25］。

同植物一樣，病菌也會產(chǎn)生生理生化上的適應(yīng)機制，來抵御UV－B輻射的傷害。UV－B輻射增強導(dǎo)致鏈格孢菌體內(nèi)CAT活性顯著上升，清除體內(nèi)活性氧自由基，降低UV－B造成的光氧化傷害。病菌抗氧化酶活性的變化與UV－B劑量率呈正相關(guān)［22］。病菌的DNA在受到UV－B損傷的同時，也在進行自我修復(fù)。從鏈格孢菌的菌絲生長率、纖維素酶及CAT活性的時間變化可以看出，經(jīng)UV－B輻射后予以一定的恢復(fù)時間，鏈格孢菌的生長及其生理活性均有一定程度的提高。鏈格孢菌對低UV－B輻射強度（5.0kJ／m2）損傷的自我修復(fù)作用更為明顯。

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