草莓內(nèi)生細(xì)菌的分離及草莓灰霉病菌拮抗菌的篩選鑒定

李 娜， 戴美學(xué)

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014）

植物內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，一旦進(jìn)入植物體內(nèi)，即可獨(dú)立繁殖和傳遞，并占據(jù)有利的生態(tài)位點(diǎn)來防止病原菌的入侵［1］。因此有益的內(nèi)生細(xì)菌有可能成為生物防治中很有發(fā)展?jié)摿Φ纳酪蜃印?/p>

草莓灰霉病是導(dǎo)致草莓產(chǎn)量和質(zhì)量降低的主要限制因素之一［2］。目前，對草莓灰霉病的防治以化學(xué)手段為主，但研究表明隨著灰霉抗性菌株的增加，化學(xué)防治的優(yōu)勢正在下降［3－4］，且存在農(nóng)藥殘留問題［5］。因此安全、低毒的生物防治已成為研究的熱點(diǎn)，作為生物制劑的木霉和酵母菌已在灰霉病的防治中發(fā)揮重大作用［6－7］。研究證明生物制劑如能阻止或減少灰霉菌對于草莓花朵的侵染，就能有效地控制灰霉病害［8］，而內(nèi)生細(xì)菌能發(fā)揮該項(xiàng)作用。

草莓內(nèi)生細(xì)菌具有通過產(chǎn)生吲哚乙酸和溶解有機(jī)磷來促進(jìn)植株生長的作用［9］，但對其生防作用的研究國內(nèi)外尚未有報(bào)道。本文對防治草莓灰霉病菌的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選，并對一株高效菌株SL6進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

董家草莓基地3個(gè)大棚中生長旺盛的草莓，在不同層次，不同區(qū)域以五點(diǎn)取樣法取草莓根、莖、葉。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000mL，pH 自然；NA：牛肉膏3.5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g、水1 000mL，pH7.0～7.2。

1.1.3 靶標(biāo)病原菌

草莓灰霉病菌（BotrytiscinereaPers.ex Fr.），本試驗(yàn)室保存菌種。

1.1.4 引物

16SR1（AGAAAGGAGGTGATCCAGCC）；16SF1（AGAGTTTGATCC TGGCTCAG）由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 草莓內(nèi)生菌的分離

1.2.1.1 表面消毒時(shí)間的選擇

為了既能保證植物組織的青翠，以獲得較多的內(nèi)生菌，又能保證表面消毒徹底，需要通過一系列試驗(yàn)尋找恰當(dāng)?shù)腍gCl2消毒時(shí)間。將草莓根、莖、葉用0.1%HgCl2處 理1、1.5、2、2.5、3、3.5、4min。然后將處理后的根、莖、葉在NA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，觀察是否有菌的生長。

1.2.1.2 表面消毒

將植物組織用清水沖洗干凈，無菌水沖洗10次，在75%乙醇中消毒5min，無菌水沖洗3次，最佳0.1%HgCl2時(shí)間消毒后，無菌水沖洗3次。

1.2.1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離

將檢出的消毒徹底的組織采用五點(diǎn)取樣法剪成0.5cm×0.5cm左右的小塊，組織勻漿器研磨充分，依次稀釋，取原液、10－1、10－2、10－3稀釋度的組織液0.1mL涂布于NA平板，每種樣品3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～5d。

1.2.1.4 內(nèi)生細(xì)菌的純化

培養(yǎng)3～5d后，挑取不同形態(tài)的菌落于NA平板上畫線純化。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選與拮抗性能測定

1.2.2.1 草莓灰霉菌拮抗菌的篩選

采用對峙培養(yǎng)法，取直徑8mm的靶標(biāo)菌菌餅置于PDA平板（d＝90mm）中央，用接種環(huán)挑取純化好的菌種點(diǎn)接在距平板中央3cm處的4個(gè)角點(diǎn)上，25℃培養(yǎng)7d后測量抑菌帶寬。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。選出對病原菌生長有抑制作用，且被抑病原菌絲邊緣平齊、拮抗作用持久的菌株。

1.2.2.2 拮抗菌株的拮抗性能測定

進(jìn)入復(fù)篩的菌株，按上述方法做對峙試驗(yàn)，以接種靶標(biāo)菌餅的平板做對照，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，25℃培養(yǎng)3～5d，直到對照平板布滿灰霉菌，測量抑菌圈半徑（細(xì)菌菌落中心至病原菌菌絲邊緣）。

1.2.2.3 SL6發(fā)酵濾液的抑菌作用測定

抑菌效果最佳的SL6菌株在37℃振蕩培養(yǎng)3d后，發(fā)酵液離心（12 000r／min，20min），取上清液用細(xì)菌過濾器（0.25μm）除菌，得無菌發(fā)酵液，取1mL發(fā)酵濾液加入到熔化的25mL PDA培養(yǎng)基中，混勻后制平板，以不加發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基為對照。同步接種草莓灰霉病菌菌絲塊，每個(gè)處理重復(fù)3次，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照板菌絲觸及平板邊緣開始測量，計(jì)算加入濾液的平板菌絲生長直徑的平均值，利用公式可得出其抑菌率。對無菌發(fā)酵濾液進(jìn)行梯度稀釋后，同樣方式，測其稀釋后的抑菌率。挑取經(jīng)過濾液處理及對照平板上的邊緣菌絲，在掃描電鏡下觀察菌絲形態(tài)。

抑菌率＝（對照板菌絲直徑一處理板菌絲直徑）／（對照板菌絲直徑一霉菌菌塊初始直徑）×100%。

1.2.3 拮抗細(xì)菌的初步鑒定

根據(jù)拮抗細(xì)菌菌株的形態(tài)、培養(yǎng)性狀和生理生化特性的測定結(jié)果，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進(jìn)行鑒定［10－11］。

1.2.4 拮抗細(xì)菌的分子鑒定

抽提拮抗菌總DNA，利用16SrDNA細(xì)菌通用引物R1和F1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收，送至上海生工生物科技公司測序。測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較。

1.2.5 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從GenBank中查找已經(jīng)測序的同屬菌的16S rDNA序列用ClustalX進(jìn)行多序列比對分析，再用MEGA4軟件中Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次Bootstraps檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 選擇HgCl2消毒時(shí)間

由表1可以看出，草莓根、莖、葉所需的0.1%HgCl2最佳消毒時(shí)間不同，根部所需處理時(shí)間最長，需3.5min。葉所需時(shí)間為3min，莖部需要2.5min，這可能與植物各個(gè)器官的生理結(jié)構(gòu)相關(guān)。

2.2 各組織中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量

由表2可知，草莓的各個(gè)組織結(jié)構(gòu)中均有內(nèi)生細(xì)菌定殖，但不同組織中內(nèi)生細(xì)菌分布的密度不同，草莓莖部內(nèi)生細(xì)菌的含量為2.29×104～3.95×104cfu／g鮮重，葉中為3.22×103～9.66×103cfu／g鮮重，草莓根部的內(nèi)生細(xì)菌的含量最少，為2.8×101～5.3×101cfu／g。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及分離部位的不同，共純化得內(nèi)生細(xì)菌54株。且不同組織結(jié)構(gòu)中內(nèi)生菌的種類也不相同，莖中分得形態(tài)顏色不同的菌株27株，葉中15株，根中12株?？梢?，內(nèi)生細(xì)菌的分布密度及種類均與所在植物的部位相關(guān)。

表2 草莓不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的含量

2.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的抑菌效果及形態(tài)學(xué)和生理生化特性的鑒定

2.3.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的拮抗能力測定

平板對峙試驗(yàn)測定結(jié)果表明，5株內(nèi)生細(xì)菌具有較為明顯的拮抗作用，抑菌半徑最低為7mm，最高的SL6可達(dá)15mm（表3、圖1）。

表3 5株內(nèi)生拮抗菌株的抑菌能力1）

2.3.2 SL6發(fā)酵濾液的拮抗作用

通過對于生長直徑的測量，運(yùn)用公式得出，SL6的發(fā)酵濾液對草莓灰霉病菌菌絲的抑制率達(dá)97.6%（圖2）。稀釋100倍后，抑菌率為53.7%，有較好的抑菌效果（圖3）。掃描電鏡下對混有發(fā)酵液及空白對照平板上菌絲的形態(tài)觀察顯示，對照菌絲光滑、修長，濾液處理組菌絲部分膨大變形甚至斷裂，原生質(zhì)體溢出（圖4）。與平板對峙試驗(yàn)中，對菌絲的作用一致。推測是活性物質(zhì)的溶菌作用所致。具體的活性物質(zhì)成分還有待于進(jìn)一步的研究。

圖1 SL6抑菌效果

圖2 SL6無菌發(fā)酵液的拮抗活性檢測

圖3 SL6無菌發(fā)酵液稀釋后的抑菌效果

2.3.2 拮抗內(nèi)生菌的形態(tài)學(xué)和生理生化測定結(jié)果

通過形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征的測定，對草莓灰霉病菌有抗菌作用的5株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果見表4、5。

表4 5株內(nèi)生拮抗菌形態(tài)及染色特征

表5 5株內(nèi)生拮抗菌生理生化測定結(jié)果1）

圖4 SL6無菌發(fā)酵液對菌絲的抑制作用

5株菌株幼齡培養(yǎng)物均成桿狀，革蘭氏陽性，芽胞為卵圓球形，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，好氧或兼性厭氧，革蘭氏陽性，接觸酶反應(yīng)呈陽性，不產(chǎn)生吲哚，確定其均歸屬于芽胞桿菌屬（Bacillussp.）［10－11］。

2.3.3 菌株SL6系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株SL6的16SrDNA PCR產(chǎn)物長度為1 487bp，此序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊序列號為FJ948786.1。由構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，SL6與芽胞桿菌屬的菌株同源性高，與枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）DCC1106（EU276080）在同一分支上，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，可鑒定菌株SL6為枯草芽胞桿菌。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

3 討論

內(nèi)生細(xì)菌定殖在植物的內(nèi)部［12］，通常能夠促進(jìn)植物的生長，且不會對植物的組織器官造成傷害［13］，是植物組織內(nèi)的正常菌群，可以通過組織學(xué)方法或從表面嚴(yán)格消毒的植物組織和汁液中分離獲得［14］。本研究表明，草莓根、莖、葉組織中均存在大量內(nèi)生細(xì)菌，各組織內(nèi)生細(xì)菌的密度不同，范圍在2.8×101～3.95×104cfu／g鮮重之間。

圖5 菌株SL6的系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究通過設(shè)計(jì)不同的梯度來確定升汞的最佳消毒時(shí)間，以達(dá)到使分離的內(nèi)生細(xì)菌盡可能真實(shí)地反映植物內(nèi)的微生物群落的效果。過長的消毒時(shí)間導(dǎo)致內(nèi)生細(xì)菌種群密度減少；消毒時(shí)間較短，附生細(xì)菌會干擾內(nèi)生細(xì)菌密度的計(jì)算；且不同組織器官，因其構(gòu)造的不同，需要的消毒時(shí)間也會有差異。

內(nèi)生菌種有很多抗性菌株，具有提取各種抗菌物質(zhì)的潛力［15－16］，是生物防治中起重要作用的生防因子。目前，從植物內(nèi)部分離得到的生防細(xì)菌已有多種，如：王書同從番茄植株中分離得到一株內(nèi)生枯草芽胞桿菌對番茄灰霉病菌的抑制率達(dá)71.1%［17］，但對草莓內(nèi)生細(xì)菌生防作用的研究，目前國內(nèi)外尚未報(bào)道，本研究從草莓中篩選得到內(nèi)生枯草芽胞桿菌SL6，其無菌發(fā)酵液對草莓灰霉病菌的抑制率可達(dá)97.6%，具有生防菌的潛能。對其發(fā)酵濾液進(jìn)行分析可知是抗菌蛋白在起作用，但分離純化的方法有待進(jìn)一步研究，以期得到在病害生物防治中能起作用的抗菌蛋白。

［1］Hallmann J，Quadt－Hallmann W F，Mahaffee A，et al.Bacterial endophytes in the agricultural crops［J］.Can J Microbiol，1997，43：895－914.

［2］Jarvis W R.The biology ofBotrytis［M］.Academic Press，1980：1－17.

［3］Rosslenbroich H J，Stuebler D.Botrytiscinerea－h(huán)istory of chemical control and novel fungicides for its management［J］.Crop Prot，2000，19：557－561.

［4］Yourman L F，Jeffers S N.Resistance to benzimidazole and dicarboximide fungicides in greenhouse isolates ofBotrytis cinerea［J］.Plant Dis，1999，83：569－575.

［5］Washington W S，Shanmuganathan N.Fungicide control of strawberry fruit rots and the field occurrence of resistance ofBotrytiscinereato iprodione，benomyl and dichlofluanid［J］.Crop Protection，1992，11（4）：355－360.

［6］Sutton J C.Evaluation of micro－organisms for biocontrol：Botrytiscinereaand strawberry，a case study［M］.Advances in Plant Pathology，1995：173－190.

［7］Lima G，Ippolito A.Effectiveness ofAureobasidiumpullulansandCandidaoleophilaagainst postharvest strawberry rots［J］.Postharv Biol And Technol，1997，10：169－178.

［8］Pedro Boff，Jürgen K?hl，Matthijs Gerlagh，et al.Biocontrol of grey mould byUlocladiumatrumapplied at different flower and fruit stages of strawberry［J］.BioControl，2002，47：193－206.

［9］Armando C F Dias，F(xiàn)rancisco E C Costa，F(xiàn)ernando D Andreote，et al.Isolation of micropropagated strawberry endophytic bacteria and assessment of their potential for plant growth promotion［J］.World J Microbiol Biotechnol，2009，25：189－195.

［10］Buchanan（布坎南）RE，Gibbons（吉本斯）NE.伯杰細(xì)菌鑒定手冊［M］.第八版.北京：科學(xué)出版社，1984.

［11］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［12］Kobayashi D Y，Palumbo J D.Bacterial endophytes and their effects on plants and uses in agriculture［J］.Microbial Endophytes，2000：199－233.

［13］Ladha J K，Reddy P M.Steps towards nitrogen fixation in rice［J］.International Rice Research Institute，2003：33－46.

［14］Stone J K，Bacon C W，White J F Jr.An overview of endophytic microbes：endophytisMdefined［M］.New York：Marcel Dekker，2000：3－29.

［15］Strobel G A.Endophytes as sources of bioactive products［J］.Microbes Infect，2003，5：535－544.

［16］Sun L J，Lu Z X.Advance on antibiotics produced by endophytes［J］.Food Ferment Ind（China），2005，31：39－41.

［17］Wang Shutong，Hu Tongle，Jiao Yanling，et al.Isolation and characterization ofBacillussubtilisEB－28，an endophytic bacteriuMstrain displaying biocontrol activity againstBotrytiscinereaPers［J］.Frontiers of Agriculture in China，2009，3（3）：247－252.