鏈霉素人工抗原的合成及其多克隆抗體的制備

張桂賢 （臨沂師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 276005)

鏈霉素(SM)作為一種重要的氨基糖苷類抗生素，具有性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、生產(chǎn)工藝簡單、療效好(尤其是具有強(qiáng)大的抗結(jié)核桿菌的作用)，因而被廣泛的應(yīng)用于動(dòng)物疾病的治療和預(yù)防上。但鏈霉素具有嚴(yán)重的耳毒性和腎毒性，它在動(dòng)物性食品中的殘留已引起國內(nèi)外的普遍關(guān)注[1-2]。目前，我國對于食品中鏈霉素殘留的檢測主要采用儀器分析方法，如氣相色譜、液相色譜及質(zhì)譜法等，這些方法雖靈敏度高，但處理過程復(fù)雜，且檢測費(fèi)用高，因此不能廣泛應(yīng)用，而免疫學(xué)檢測法是未來抗生素殘留檢測的首選方法，而應(yīng)用單克隆抗體建立的ELISA法可在生產(chǎn)過程中用于大量樣本的快速篩選檢測[3-4]。所以本試驗(yàn)研究目的在于制備鏈霉素的多克隆抗體，為鏈霉素殘留的免疫學(xué)檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與器材 鏈霉素(Streptomycin，SM)購自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司(批號F030405)；卵清蛋白(OVA)購自Sigma公司(批號BP0123)HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北京鼎國生物公司；U-1800型紫外分光光度計(jì)由日本日立公司生產(chǎn)；SUNRISE型酶標(biāo)儀由瑞士TECAN公司生產(chǎn)；96孔可拆式酶標(biāo)板由浙江省臨海市華威分析儀器有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級BALB/C純系小鼠4只，由臨沂師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 主要溶液 pH9.6碳酸鹽緩沖液: 1.7g Na2CO3，2.8g NaHCO3定容于1000ml 超純水中，4℃冰箱保存。NaOH試液：取NaOH4.3g，加入雙蒸水至100ml。硫酸鐵胺試液：取硫酸鐵胺0.1g，加入0.5mol/L的硫酸溶液至5ml，使之溶解完全。包被緩沖液(pH 9.6)：準(zhǔn)確稱取NaCO30.85g，NaHCO31.4g，雙蒸水定容至500mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩H7.4 0.01mol/L的PBS：準(zhǔn)確稱取KH2PO40.2g、KCL 0.1g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、NaCl 8.0g，加雙蒸水溶解，定容至1000m，4℃冰箱保存。洗滌液：每100ml pH7.4 PBS中加入50μl的Tween-20，搖勻即可，4℃冰箱保存。封閉液(5%脫脂乳)：稱取5g脫脂奶粉溶于100ml pH7.4PBS中，4℃冰箱保存。抗體稀釋液：pH7.40.01mol/L的PBS，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。底物緩沖液：枸櫞酸-磷酸緩沖液(枸櫞酸0.51g，1.84g Na2HPO4·12H2O定容于100ml純水中)，4℃冰箱保存。顯色液：準(zhǔn)確稱取OPD(鄰苯二胺)5mg，溶于10ml底物緩沖液中，再加入30%H2O 15μl，混勻即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。終止液(10%硫酸)：量取濃硫酸10ml，逐滴加入到90ml雙蒸水中，混勻，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的制備 制備方法采用直接化學(xué)交聯(lián)法，鏈霉素可以利用分子中的醛基和蛋白質(zhì)的氨基直接縮合，反應(yīng)路線見圖1[5]：

圖1 SM與載體蛋白合成路線

具體合成路線:（1）稱取BSA 50mg，溶解于6ml的pH為9.6的碳酸鹽緩沖液中。（2）稱取鏈霉素 82.5mg 溶解于4ml的pH為9.6的碳酸鹽緩沖液中。（3）將上述兩種溶液混合，并于37℃ 輕微攪拌反應(yīng)12h。（4）將反應(yīng)液收集用pH7.20.01mol/L的磷酸緩沖液透析48h。并收集12h、24h、48h的透析液。（5）將透析后的反應(yīng)物小量分裝-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

將卵清蛋白與鏈霉素的偶聯(lián)也采用同樣方法，將偶聯(lián)物作為包被原，用于間接ELISA法。

1.2.2 人工抗原的鑒定 (1)顯色反應(yīng)。鏈霉素在堿性溶液中，分子發(fā)生重排，使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺和鏈霉胍，生成麥芽酚(α-甲基-β-羧基-γ-吡喃酮)，麥芽酚與硫酸鐵銨溶液形成紫紅色配位化合物[6]。根據(jù)鏈霉素所特有的性質(zhì)可以通過麥芽酚反應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，通過對透析后產(chǎn)物進(jìn)行麥芽酚反應(yīng)初步鑒定鏈霉素是否聯(lián)結(jié)成功，同樣對透析外液進(jìn)此反應(yīng)可以初步鑒定反應(yīng)物是否透析完全。透析產(chǎn)物最終通過紫外分光光度計(jì)來進(jìn)一步確定是否連接成功，并估算人工抗原的濃度，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。具體作法：將不同時(shí)段收集的透析液分別取1ml，然后加入0.3mL NaOH試液。37℃水浴3min后，加入0.5ml硫酸鐵胺試液顯色，如果有紫紅色，則說明含有鏈霉素，如果沒有則透析干凈了。確定透析外液不含鏈霉素后，則取透析后的反應(yīng)物1ml，然后加入0.3ml NaOH試液。37℃水浴3min后，冷卻至室溫后，加入0.5ml硫酸鐵胺試液顯色，如果有紫紅色，則說明含有鏈霉素，聯(lián)結(jié)成功。（2）紫外掃描。用PBS配制好標(biāo)準(zhǔn)溶液(SM、BSA和OVA)及人工抗原(SMBSA和SM-OVA)溶液，通過紫外分光光度計(jì)掃描，比較透析產(chǎn)物的特征峰是否是鏈霉素和蛋白載體特征峰的疊加，且出現(xiàn)了偏移。透析產(chǎn)物通過紫外分光光度計(jì)來初步確定是否交聯(lián)成功，參考楊利國[7]，OD280/OD260＜1.5時(shí)，蛋白質(zhì)含量(mg/ml)=(1.45×OD280- 0.74×OD260)×稀釋倍數(shù)，粗略估算結(jié)合蛋白的濃度，以確定小鼠的免疫劑量。

1.2.3 動(dòng)物免疫 將小鼠編號，并做好標(biāo)記，取一定量制備成功的免疫原(SM-BSA)與等體積的弗氏完全佐劑乳化，依據(jù)估算濃度保證每只BALB/C小鼠的劑量100μg/只，0.2ml/只[8]，腹腔注射。第14、35d將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑同法進(jìn)行加強(qiáng)免役，自二免后的每免7～10d斷尾采血，2000rpm離心5min分離得到多抗血清。

1.2.4 多抗血清的檢測 對標(biāo)記小鼠，斷尾采血，將包被原1:40稀釋，抗血清1:100稀釋，二抗采用1:1000稀釋，按照表1間接ELISA流程表[9]測定抗血清效價(jià)，用P表示測定值，N表示陰性對照值，結(jié)果以P/N﹥2.1且P-N﹥0.2為臨界判定值。

表1 間接ELISA的流程表

1.2.5 多抗血清的特異性分析 參考文獻(xiàn)[10]將鏈霉素用0.01mol/l pH7.4的PBS稀釋成一系列濃度(10000、1000、100、10、1、0.1ng/ml)，分別取100μl與濃度為1:100的多抗100μl在離心管中混勻，置37℃溫箱中孵育30min。分別取100μl加入預(yù)先用最適抗原包被濃度包被好的酶標(biāo)板中，同種濃度的SM作2個(gè)重復(fù)，其他操作同上表1。B/B0%=OD490實(shí)驗(yàn)組/OD490對照組×100%，以鏈霉素濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，B/B0%為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和IC50(B/B0%=50%)值?？贵w特異性試驗(yàn)：將鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素、硫酸新霉素配制成系列藥物濃度，作競爭抑制實(shí)驗(yàn)，求出各自的IC50，根據(jù)交叉反應(yīng)率= IC50鏈霉素/ IC50試驗(yàn)組藥物×100%，求出各自的交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

2.1.1 顯色反應(yīng) 鏈霉素麥芽酚顯色反應(yīng)結(jié)果表明：12h后的透析外液有顏色反應(yīng)，24h后的沒有顏色反應(yīng)，則表明透析外液基本不含鏈霉素，透析基本完全。收集48h后透析產(chǎn)物，經(jīng)過麥芽酚反應(yīng)顯色(紫紅色)明顯，這說明透析產(chǎn)物存在且聯(lián)結(jié)在蛋白質(zhì)上，初步確定鏈霉素與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)成功。

2.1.2 UV鑒定

圖2 載體蛋白質(zhì)和偶聯(lián)物紫外掃描圖

BSA、OVA、SM、SM-BSA和SM-OVA五個(gè)樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描，結(jié)果(見圖2)顯示SM無明顯紫外吸收峰與資料[11]吻合，BSA和OVA分別在278.5nm和279nm波長處有最大吸收峰，SM-BSA和SM-OVA的最大吸收峰分別在278nm和279.5nm波長處。根據(jù)UV吸收的合加性原理可知，整合后的特征峰與半抗原和載體沒有重合，出現(xiàn)了偏移，說明半抗原SM已分別與載體BSA和OVA交聯(lián)成功。

掃描SM-BSA，OD(280)值為0.64，OD(260)值為0.44，估算SM-BSA結(jié)合蛋白含量為1.65mg/ml；掃描SM-OVA，OD(280)值為0.54，OD(260)為0.33，估算SMOVA結(jié)合蛋白含量為0.54mg/ml。

2.2 多抗血清效價(jià)測定與特異性分析

對三免后的標(biāo)記小鼠斷尾采血，間接ELISA測定OD值，3只小鼠均出現(xiàn)了陽性結(jié)果見表2，效價(jià)1:51200。

表2 多抗血清OD值

2.3 多抗血清特異性分析

圖3 鏈霉素間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

間接競爭ELISA阻斷試驗(yàn)結(jié)果見圖3，鏈霉素濃度在1ng/ml～100ng/ml范圍內(nèi)，小鼠多抗抑制曲線呈良好的線性關(guān)系，其中鼠3抑制性最好，其抑制曲線回歸方程為y=-19.96x+77.42 R2=0.9695，鼠3的IC50為23.62ng/ml，低于鼠2和鼠3。交叉試驗(yàn)結(jié)果(見表3)表明鏈霉素多抗與雙氫鏈霉素交叉達(dá)107%，而與同類的其他藥物無交叉反應(yīng)。

表3 間接競爭ELISA的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 人工抗原的合成

鏈霉素屬于不含伯胺基的氨基糖苷類抗生素，可采用兩種方法制備免疫原。（1）利用醛基可以采用O-(羧甲基)羥基胺法，將其生成含有帶羧基的半抗原衍生物，然后采用碳化二亞胺法，將帶有羧基的半抗原與載體蛋白的胺基或者羧基結(jié)合[11]。（2）利用鏈霉素其醛基直接與載體蛋白的胺基縮和[5]。本試驗(yàn)采用了方法（2）。此法試驗(yàn)條件容易控制，且所需試劑常用價(jià)廉，抗原的合成易于實(shí)現(xiàn)。

3.2 人工抗原的鑒定

鏈霉素以PBS配制進(jìn)行UV掃描，由于PBS自身的干擾使SM的紫外吸收峰不明顯，但同濃度偶聯(lián)物與鏈霉素的紫外吸收峰，并沒有重合，說明偶聯(lián)成功，因鏈霉素特有的麥芽酚顯色試驗(yàn)更充分證明偶聯(lián)物含有鏈霉素成分，說明人工抗原制備成功。

3.3 動(dòng)物免疫

在免疫動(dòng)物時(shí)，筆者曾采用尾靜脈對小鼠加強(qiáng)免疫，但免疫效果不好，小鼠會(huì)在免疫后出現(xiàn)嚴(yán)重的副反應(yīng)，分析原因是免疫原直接進(jìn)入小鼠循環(huán)系統(tǒng)，造成不良應(yīng)激所致，因此建議采用腹腔或背部皮下注射，此法易于操作，對小鼠的應(yīng)激小，免疫效果較好。

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