膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移作用的實(shí)驗(yàn)研究

李傳友 高宜錄

河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科（453000）

自從神經(jīng)干細(xì)胞成功分離，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療上存在的諸多問(wèn)題的解決提供了可行辦法。但是，如何使移植神經(jīng)干細(xì)胞準(zhǔn)確有效的遷入其所需部位并分化是近年神經(jīng)科學(xué)工作者所關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移誘導(dǎo)作用，為將來(lái)神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠由南通醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，C6細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，5-BrdU購(gòu)自NEOMARKERS公司，Mouse Anti-Nestin IgG1購(gòu)自CHEMICON公司，Mouse Anti-BrdU IgG1為NEOMARKERS公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

選用1～2d的SD大鼠，碘伏消毒后，在超凈臺(tái)下解剖暴露兩側(cè)大腦半球及小腦，取少許兩側(cè)大腦皮層組織，大小約1mm3，放入DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌兩遍，盡量將組織剪碎；將皮層組織轉(zhuǎn)移至10mL玻璃離心管并加入6～8mL DMEM/F12培養(yǎng)液，用毛細(xì)吸管將皮層組織機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，篩網(wǎng)過(guò)濾，離心（500r/min）5min，棄上清液并用bFGF2、B27、D MEM/F12培養(yǎng)基定容，細(xì)胞記數(shù)。按25cm2培養(yǎng)瓶中接種1×106個(gè)/4mL進(jìn)行接種。將培養(yǎng)瓶放入37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～7d原代神經(jīng)細(xì)胞球形成。3～4d更換培養(yǎng)液。

將原代神經(jīng)球吹打制成單細(xì)胞懸液，接種至含Brdu（濃度為5μmol/L）的bFGF2、B27、DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～7d即可形成次代神經(jīng)球。換液同前。

1.2.2 Nestin和 Brdu免疫熒光檢測(cè)

Nestin免疫熒光檢測(cè)：①貼壁：將培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞球吸出，接種至置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片（多聚賴(lài)氨酸包被），放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，使神經(jīng)細(xì)胞球貼壁。②固定：吸去培養(yǎng)液加入4%多聚甲醛少許，室溫下固定30min，去除固定液，PBS洗滌3次，每次10min。③封閉：用含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃條件下孵育封閉10min。④檢測(cè)：加一抗（小鼠抗Nestin IgG1按1∶500倍稀釋?zhuān)?，放?℃冰箱過(guò)夜，吸去一抗，洗滌同前。再加入二抗（FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，按1∶150倍稀釋?zhuān)芄猓?7℃水浴箱內(nèi)孵育30min，吸去二抗，洗滌同前。⑤觀(guān)察記錄：在激發(fā)光波長(zhǎng)為490nm，濾色光波長(zhǎng)為520nm的共聚焦顯微鏡下觀(guān)察照相（圖1）。

Brdu免疫熒光檢測(cè)：①貼壁；②固定；③封閉。方法同Nestin檢測(cè)。④檢測(cè)：一抗為小鼠抗Brdu IgG1 （按1∶1000倍稀釋?zhuān)?，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（按1∶200倍稀釋?zhuān)?，余操作同前。⑤觀(guān)察記錄（圖2）。

1.2.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)

將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞分別接種在置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)的半圓蓋玻片上（多聚賴(lài)氨酸已包被），用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4h使細(xì)胞貼壁，將膠質(zhì)瘤細(xì)胞所貼壁的蓋玻片與神經(jīng)干細(xì)胞貼壁的蓋玻片一起放在24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，并設(shè)空白對(duì)照，觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)及其形態(tài)學(xué)變化（圖3）。

2 結(jié) 果

2.1 Nestin和 Brdu免疫熒光檢測(cè)

Nestin即巢蛋白，是一種僅存于神經(jīng)上皮干細(xì)胞的中間絲成分，可作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物。我們通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞均呈Nestin陽(yáng)性。從而證明我們培養(yǎng)的細(xì)胞球是神經(jīng)干細(xì)胞球。

5-BrdU免疫熒光檢測(cè)：5-BrdU即5-溴-2脫氧尿苷，它是胸腺嘧啶核苷的替代品。在細(xì)胞分裂的DNA合成前期，可以作為底物結(jié)合到新合成的DNA中，從而可驗(yàn)證神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。我們將用含5-BrdU的培養(yǎng)液培養(yǎng)形成的次代神經(jīng)細(xì)胞球進(jìn)行抗-BrdU免疫熒光檢測(cè)顯示，絕大多數(shù)細(xì)胞呈BrdU陽(yáng)性。

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞傳代能力鑒定

圖3 神經(jīng)干細(xì)胞和C6細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)（20×）

2.2 C6細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)

C6細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，可觀(guān)察到神經(jīng)干細(xì)胞分化，長(zhǎng)出細(xì)胞突起，神經(jīng)細(xì)胞球周?chē)募?xì)胞突起的密度及長(zhǎng)度在各個(gè)方向上有明顯的差異，在靠近膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一側(cè)，突起的密度及長(zhǎng)度均大于在其他方向上的突起，并且可見(jiàn)部分干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞方向移動(dòng)了。

3 討 論

3.1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

自1992年Reynolds等[1]首先報(bào)道自成年小鼠紋狀體分離培養(yǎng)出能在體外不斷增殖，具有多種分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞以來(lái)，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的研究便成為熱點(diǎn)。后來(lái)的研究又在海馬齒狀回、脊髓、隔區(qū)、紋狀體的實(shí)質(zhì)及人的大腦內(nèi)均成功分離出神經(jīng)干細(xì)胞[2-4]。近年，分離、培養(yǎng)干細(xì)胞的技術(shù)日臻成熟。從實(shí)驗(yàn)用神經(jīng)干細(xì)胞獲取的角度看，從胎腦的紋狀體區(qū)和海馬齒狀回容易獲得，但對(duì)動(dòng)物和取材技術(shù)要求較高。用成熟大鼠取材對(duì)培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基要求又較高，不易存活。我們從新生大鼠大腦皮層分離培養(yǎng)出了具有分裂增殖能力的神經(jīng)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下形成典型的神經(jīng)細(xì)胞球。Nestin免疫熒光染色為Nestin陽(yáng)性，并通過(guò)5-BrdU免疫熒光染色證實(shí)這些細(xì)胞具有分裂增殖能力。說(shuō)明新生大鼠皮層可培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞。我們的體會(huì)是從新生大鼠皮層分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物容易獲得、取材簡(jiǎn)單、一次可獲得大量干細(xì)胞和干細(xì)胞易成活的優(yōu)點(diǎn)。

3.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)

Qu等[5]將神經(jīng)干細(xì)胞注入2歲大鼠的側(cè)腦室，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞在鼠腦內(nèi)出現(xiàn)對(duì)稱(chēng)性遷移并分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；Corbin等[6,7]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元有兩種不同的遷移方式，即放射狀遷移和正切遷移。這些研究提示，在成年人腦內(nèi)可能有特定的誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的機(jī)制和信號(hào)物質(zhì)。Kim等[8]的研究初步證明了這一點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)端腦的GABA類(lèi)聯(lián)絡(luò)神經(jīng)元和小腦的谷氨酸類(lèi)神經(jīng)元分泌至細(xì)胞外基質(zhì)的一種名為Reelin的糖蛋白，在神經(jīng)干細(xì)胞的遷移中起重要作用。更有趣的是，Karen等[9]發(fā)現(xiàn)將神經(jīng)干細(xì)胞移植至有移植膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的鼠腦內(nèi)，神經(jīng)干細(xì)胞很快充滿(mǎn)腫瘤，并沿著浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞而分布，即使將神經(jīng)干細(xì)胞接種在腫瘤的遠(yuǎn)隔部位，甚至把神經(jīng)干細(xì)胞接種在對(duì)側(cè)大腦半球和側(cè)腦室，它們也可穿過(guò)正常腦組織移行入膠質(zhì)瘤。這說(shuō)明膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)環(huán)境中或膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身存在著引導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的信號(hào)物質(zhì)。假設(shè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生這種信號(hào)物質(zhì)，那么在體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞也應(yīng)該有這種作用，如果我們能證實(shí)這種作用，即說(shuō)明膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在引導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的物質(zhì)。于是，我們首先設(shè)計(jì)了限定區(qū)域共培養(yǎng)的方法在體外培養(yǎng)條件下觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)及其形態(tài)學(xué)變化。在實(shí)驗(yàn)中，我們從形態(tài)學(xué)方面觀(guān)察到與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)遷移和分化現(xiàn)象，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。但該研究已初步說(shuō)明在體外培養(yǎng)條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移作用。從而為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的機(jī)制，并為神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床，提高腦及脊髓損傷、膠質(zhì)瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療效果奠定了一定的基礎(chǔ)。

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