響應(yīng)面法優(yōu)化荸薺皮總黃酮的提取工藝

高 山，胡 平，龍世平

(1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，湖北 恩施 445000)

荸薺(Eleocharistuberose)，別名馬蹄、地栗等，是莎草科多年生淺水草本植物[1]，分布廣泛[2]。除直接食用外，還被加工成淀粉、果脯、罐頭和飲料等產(chǎn)品[3]。研究表明，荸薺皮中含有一種不耐熱的抑菌物質(zhì)——荸薺英，荸薺英中含有游離黃酮類化合物、生物堿、有機(jī)酸、皂苷及酚類等成分[4～6]，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、綠膿桿菌等均有不同程度的抑制作用，可作為一種天然食品防腐劑用于食品加工[7]。黃酮類化合物具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)人體免疫力的功能，并對糖尿病、高血壓、冠心病等疾病有輔助療效[8]，因此，研究荸薺皮中黃酮類化合物的提取工藝對提高荸薺的附加值意義重大。

黃酮類化合物常用的提取工藝主要有水提法[9]、微波法[10]、超濾法[11]等，對于提取工藝的優(yōu)化多采用正交實(shí)驗(yàn)法[12]，而采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝的較少。作者在此采用響應(yīng)面分析法[13]對荸薺皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，擬為荸薺皮的綜合利用提供一條新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

荸薺皮：收集于恩施市土橋壩各鮮荸薺市場，剔除雜質(zhì)及腐跡，于干燥箱中80℃烘6 h，再用粉碎機(jī)粉碎，過篩，保存，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，95%乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇溶解，并全部轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，搖勻，得濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL于7支25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，混勻，用30%乙醇定容；15 min后于510 nm處測定吸光度A，以試劑空白作為參比。

1.2.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取干燥荸薺皮粉末1 g，加入30%乙醇25 mL，在水浴提取溫度60℃下提取90 min，迅速冷卻，于8000 r·min-1離心8 min，得提取液。

1.2.3 黃酮類化合物含量的測定

準(zhǔn)確吸取提取液2.5 mL于25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，混勻，用30%乙醇定容；15 min后于510 nm處測定吸光度，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出提取液黃酮類化合物濃度，按下式計(jì)算黃酮類化合物含量：

式中：Q為黃酮類化合物含量，mg·g-1；c為測定液黃酮類化合物濃度，mg·mL-1；V1為測量時(shí)定容的體積，mL；V2為提取液體積，mL；V3為測量時(shí)提取液體積，mL；m為提取時(shí)荸薺皮質(zhì)量，g。

1.2.4 荸薺皮總黃酮提取條件的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測定提取液的吸光度，計(jì)算荸薺皮粉末中總黃酮的提取量(Y)。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼水平見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼水平

1.2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對主要因素采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用SAS軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，以獲取最佳工藝參數(shù)[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同濃度時(shí)所對應(yīng)的吸光度，以濃度為橫縱標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c(mg·mL-1)與 吸光度A的回歸方程為A=0.1765c+0.003，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，表明吸光度與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈顯著線性相關(guān)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.4.1方法對荸薺皮粉末進(jìn)行提取，得到各提取條件下的總黃酮提取量見圖2。

圖2 單因素對總黃酮提取量的影響

由圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮類化合物提取量不斷增加，由于50%相比于40%的提取量增加不大，考慮到成本，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%為中心點(diǎn)做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；固液比為1∶10時(shí)，黃酮類化合物提取量較低，說明受黃酮類化合物溶解度的影響，太小的固液比造成荸薺皮中的黃酮類化合物溶解不完全，而固液比1∶15與1∶30的變化不大，考慮到在提取過程中提取液要揮發(fā)，固液比太小時(shí)操作不便，故選擇固液比1∶20為中心點(diǎn)做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；隨著溫度的升高，黃酮類化合物的提取量逐漸增加，當(dāng)溫度升高到70℃時(shí)，黃酮類化合物提取量最高，故選擇提取溫度60℃為中心點(diǎn)做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；黃酮類化合物的提取量在提取時(shí)間為90 min時(shí)達(dá)到最高，然后隨提取時(shí)間的延長趨于穩(wěn)定，綜合考慮，選擇提取時(shí)間為90 min，不采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、固液比對荸薺皮中總黃酮的提取量有顯著影響。因此，固定提取時(shí)間為90 min，通過響應(yīng)面分析對乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、固液比3個(gè)因素進(jìn)行更深入的研究。

2.3.1 Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化荸薺皮總黃酮提取工藝

根據(jù)Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并采用響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。中心組合實(shí)驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表2，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素水平

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

圖3 荸薺皮總黃酮提取量影響因素的響應(yīng)面分析

表4 方差分析

由表4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最大，達(dá)到極其顯著水平(P<0.001)，提取溫度、固液比、各平方項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的交互項(xiàng)也對荸薺皮總黃酮提取量影響顯著(P<0.05)。

2.3.2 二次響應(yīng)面回歸模型的建立

響應(yīng)面軟件分析結(jié)果經(jīng)回歸擬合后，得如下回歸方程：

s=0.2991，R-sq=97.7%，R-sq(adj)=93.7%。表明模型的擬合性很好。

響應(yīng)面分析各因素之間的交互作用結(jié)果見圖3。

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對荸薺皮總黃酮提取量的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；而固液比與提取溫度次之，相應(yīng)表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

對Xi求偏導(dǎo)并令其為零的三元一次方程組為：

解三元一次方程組得：X1=-0.61、X2=0.32、X3=0.34,即最佳工藝條件為：提取時(shí)間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)33.9%、提取溫度56.8℃、固液比1∶21.7(g∶mL)。預(yù)測荸薺皮總黃酮提取量為12.65 mg·mL-1。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取荸薺皮2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為33.9%、提取溫度為56.8℃、固液比為1∶21.7(g∶mL)的最佳條件下進(jìn)行提取，3次實(shí)驗(yàn)得到的總黃酮提取量分別為12.51 mg·mL-1、12.48 mg·mL-1、12.50 mg·mL-1，平均提取量為12.50 mg·mL-1。實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值基本一致，可見該模型能較好地預(yù)測荸薺皮總黃酮的提取情況。

3 結(jié)論

通過對預(yù)測模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，荸薺皮總黃酮提取量達(dá)12.50 mg·mL-1，與模型預(yù)測值基本一致，說明模型能較好地反映實(shí)際情況，利用響應(yīng)面分析法得到的荸薺皮總黃酮的提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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