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    液相色譜法純化固相合成戈那瑞林

    2010-06-05 01:45:44肖建國,阮振興,王林鵬
    化學(xué)與生物工程 2010年9期
    關(guān)鍵詞:粗品樣量緩沖溶液

    戈那瑞林是治療前列腺癌等與雌激素相關(guān)疾病的藥物。戈那瑞林為促性腺激素釋放素,通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合垂體LH-RH的大部分受體,使LH和FSH的生成和釋放呈一過性增強(qiáng),但這種刺激的持續(xù),會(huì)導(dǎo)致受體的吞噬、分解增多,受體數(shù)減少,垂體細(xì)胞反應(yīng)下降,LH和FSH分泌能力降低,因而抑制卵巢雌激素的生成。通過這種負(fù)反饋?zhàn)饔靡种拼贵w功能,從而起到治療作用。連續(xù)使用可使LH和LH-RH分泌減少。戈那瑞林屬于十肽化合物,其結(jié)構(gòu)與天然提取物完全相同。其肽鏈結(jié)構(gòu)為:Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2[1]。目前,戈那瑞林一般通過多肽化學(xué)合成的方法獲得。

    多肽化學(xué)合成技術(shù)已較為成熟[2,3],上海麗珠制藥有限公司應(yīng)用DCCI/tBoc固相化學(xué)合成技術(shù),研制出了一條簡(jiǎn)單、有效的戈那瑞林合成工藝路線。但是,化學(xué)合成的多肽常常含有大量雜質(zhì),由于小部分雜質(zhì)與目的產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上十分相近, 給多肽的分離純化帶來了困難。

    反相液相色譜法在多肽的分離純化中顯示出優(yōu)越的分離能力[4~12]。甘一如等[13]利用離子交換制備色譜和反相高效液相制備色譜在選擇性上的差異成功地分離純化出高質(zhì)量的胸腺素α1,第一步采用陰離子交換色譜DEAE Sepharose Fast Flow除去粗品中的大部分非極性雜質(zhì),第二步用制備型反相高效液相色譜進(jìn)一步純化。最終胸腺素α1樣品通過分析型反相液相色譜分析,其純度達(dá)到95%以上。對(duì)于固相合成的戈那瑞林粗品,作者利用離子交換色譜和制備型反相高效液相色譜在選擇性上的差異成功地分離純化出高質(zhì)量的戈那瑞林,其純度達(dá)到98.5%以上,達(dá)到注射劑要求。同甘一如等[13]方法相比,本方法所制備的多肽純度提高3%以上;同只用制備型反相高效液相色譜一步純化相比,本方法上樣量提高10倍。本方法有較高的經(jīng)濟(jì)效益。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 試劑、儀器和填料

    1.1.1 試劑

    乙腈、三氟乙酸(TFA)、醋酸鈉、醋酸、氯化鈉、三乙胺、磷酸,分析純,上海化學(xué)試劑公司;注射用水、戈那瑞林粗品,自制;戈那瑞林標(biāo)準(zhǔn)品,國家藥品生物制品檢定所。

    1.1.2 儀器

    離子交換色譜系統(tǒng),國產(chǎn),自行組裝;Waters Prep LC 4000 System、Waters 510 HPLC,Waters 公司。

    1.1.3 填料

    CM 25 Sepharose Fast Flow,Pharmacia公司。

    CMC填料,國產(chǎn)。

    制備型反相高效液相色譜填料:C18,300 mm×50 mm,15 μm,DeltaPakTM。

    分析型反相高效液相色譜填料:C18,200 mm×4.6 mm,5 μm,DiamonsilTM。

    1.2 步驟與條件

    離子交換色譜:緩沖溶液A:50 mmol·L-1醋酸鈉緩沖溶液,pH值6.0。緩沖溶液B:500 mmol·L-1氯化鈉、50 mmol·L-1醋酸鈉緩沖溶液,pH值6.0。流速為10 mL·min-1。用緩沖溶液A平衡柱子使pH值為6.0;用緩沖溶液A溶解粗品,用0.45 μm微孔濾膜過濾;上樣,用緩沖溶液A平衡柱子使pH值為6.0;用緩沖溶液B洗脫,檢測(cè)波長為280 nm,當(dāng)紫外吸收值上升時(shí)收集樣品,紫外吸收值不再上升時(shí)停止收集。

    分析型反相高效液相色譜:以0.1 mol·L-1磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0)-乙腈(85∶15)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長為220 nm,進(jìn)樣量為 20 μL。

    1.3 方法

    稱取500 mg DCCI/tBoc化學(xué)合成的戈那瑞林粗品,用離子交換色譜緩沖溶液A溶解,定容至500 mL,得到1 mg·mL-1粗品溶液,經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后供離子交換色譜用。

    離子交換后的樣品不需要經(jīng)過濃縮、脫鹽處理以及調(diào)pH值,直接進(jìn)行下一步制備型反相高效液相色譜操作。用制備型反相高效液相色譜的流動(dòng)相A溶解離子交換后的樣品,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 紫外波長的確定

    戈那瑞林含芳香族氨基酸酪氨酸和色氨酸,在紫外280 nm 處有強(qiáng)烈的吸收。而肽鍵的強(qiáng)吸收峰在紫外220 nm 處。為了有效地分離純化,在離子交換色譜和制備型反相高效液相色譜純化制備時(shí),紫外波長設(shè)在280 nm處。為保證較高的檢測(cè)靈敏度,在用分析型反相高效液相色譜檢測(cè)樣品時(shí),將戈那瑞林的波長設(shè)在220 nm 處。在純化制備和樣品分析時(shí)分別采用不同的波長,這樣可有效保證純化樣品的純度和分析結(jié)果的可靠性。

    2.2 化學(xué)合成戈那瑞林的反相高效液相色譜分析(圖1)

    圖1 戈那瑞林標(biāo)準(zhǔn)品(a)和粗品(b)的RP-HPLC圖譜

    由圖1可知,戈那瑞林的保留時(shí)間為16.9 min,通過積分法測(cè)得戈那瑞林粗品的純度為75.4%。化學(xué)合成法得到的戈那瑞林粗品組成較復(fù)雜,含有部分結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和目標(biāo)物相近的雜質(zhì),嚴(yán)重干擾了戈那瑞林的定性定量。在本條件下,目標(biāo)峰和其周圍的雜質(zhì)峰能得到較好的分離,表明該條件適宜戈那瑞林粗品的分析,也適用于純化戈那瑞林樣品以及戈那瑞林純品的分析。

    2.3 離子交換色譜條件的選擇

    按 1.2方法用離子交換色譜對(duì)戈那瑞林進(jìn)行CM 25 Sepharose Fast Flow離子交換分離,將離子交換后的戈那瑞林按1.2方法用分析型反相高效液相色譜分析,結(jié)果見圖2。

    圖2 戈那瑞林離子交換后的RP-HPLC圖譜

    由圖2可見,選用CM 25 Sepharose Fast Flow填料離子交換后戈那瑞林和其它雜質(zhì)得到一定的分離,主峰相對(duì)增高,雜峰相對(duì)降低。計(jì)算得戈那瑞林的純度為85%、收率為80%,純度有了較大提高。達(dá)到了對(duì)戈那瑞林粗品進(jìn)行初步分離純化的目的。更為重要的是,由于大部分非極性雜質(zhì)不能被離子交換吸附,故可以通過離子交換法除去這部分非極性雜質(zhì)。

    實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),按1.2方法用離子交換色譜對(duì)戈那瑞林進(jìn)行CMC離子交換色譜,戈那瑞林也能被吸附,但雜質(zhì)峰除去較少,基本達(dá)不到分離的目的。

    同時(shí)考察了緩沖體系的 pH 值對(duì)分離效果的影響。選用 pH值為5.0、4.0的緩沖體系作進(jìn)一步的研究,發(fā)現(xiàn)戈那瑞林也能被吸附,但雜質(zhì)峰除去較少,基本達(dá)不到分離的目的。緩沖體系的 pH 值通過改變?nèi)苜|(zhì)的分配系數(shù)影響分離效果。選用pH值為6.0的緩沖體系可以達(dá)到分離的目的。

    2.4 反相高效液相色譜條件的選擇

    對(duì)離子交換色譜所得的樣品,按1.2方法用制備型反相高效液相色譜操作,上樣沒有流穿。反相高效液相制備色譜過程圖譜見圖3。所得戈那瑞林樣品按1.2方法用分析型反相高效液相色譜分析,結(jié)果見圖4。

    圖3 戈那瑞林反相高效液相色譜制備過程圖譜

    由圖3可見,目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰較好地分離,達(dá)到了很好的分離效果。

    圖4 純化戈那瑞林反相高效液相圖譜

    由圖4可見,經(jīng)過反相高效液相色譜純化幾乎除去了所有雜質(zhì),戈那瑞林的純度大大提高, 計(jì)算得戈那瑞林的純度達(dá)到98.5%以上,收率達(dá)90%。

    本實(shí)驗(yàn)曾嘗試采用磷酸三乙胺體系進(jìn)行反相高效液相色譜純化,結(jié)果目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰有一定程度重疊,不能分開,分辨率和收率都較低。因此,最終確定采用TFA體系進(jìn)行反相高效液相色譜純化。

    2.5 反相高效液相色譜一步純化戈那瑞林粗品的考察

    本實(shí)驗(yàn)嘗試采用反相高效液相色譜一步純化戈那瑞林粗品。上樣量為 500 mg,其它色譜條件與1.2相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上樣時(shí)有流穿現(xiàn)象,一步純化后產(chǎn)物的純度只達(dá)到89.9%;降低上樣量到250 mg,上樣時(shí)仍有流穿現(xiàn)象,一步純化后產(chǎn)物的純度只達(dá)到91.3%;進(jìn)一步降低上樣量到100 mg,上樣時(shí)仍有流穿現(xiàn)象,一步純化后產(chǎn)物的純度只達(dá)到95.4%;最后上樣量降低到50 mg,一步純化后產(chǎn)物的純度才達(dá)到98.8%。這可能是由于化學(xué)合成的戈那瑞林粗品中往往含有一些雜質(zhì),其分子結(jié)構(gòu)與戈那瑞林十分相似,其反相色譜行為也與戈那瑞林十分接近,只用反相色譜法不能使化學(xué)合成的戈那瑞林得到有效的分離純化。而這些雜質(zhì)可以通過離子交換色譜有效地除去。

    3 結(jié)論

    針對(duì)DCCI/tBoc 固相化學(xué)合成戈那瑞林粗品,建立了一條聯(lián)合應(yīng)用離子交換色譜和反相高效液相色譜純化路線。第一步采用陽離子交換色譜CM 25 Sepharose Fast Flow除去粗品中的大部分非極性雜質(zhì)和部分極性雜質(zhì),第二步采用制備型反相高效液相色譜(C18色譜柱)除去大部分雜質(zhì)。最終產(chǎn)品純度達(dá)98.5%以上,純化總收率達(dá)72%。本方法聯(lián)合利用離子交換色譜和反相高效液相色譜各自的優(yōu)勢(shì),大大提高了反相高效液相色譜的上樣量和分離效率,有利于提高反相高效液相色譜的壽命和利用效率,從而獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。離子交換后的戈那瑞林樣品溶液不需要脫鹽和濃縮處理以及調(diào)pH值,直接上樣進(jìn)行下一步的純化,簡(jiǎn)化了操作,提高了產(chǎn)品的收率和質(zhì)量。由于離子交換色譜和反相高效液相色譜都容易放大生產(chǎn),故本方法易于放大生產(chǎn)。

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