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    NDV+IL-12聯(lián)合應(yīng)用抗小鼠S180肉瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

    2010-06-05 08:16:54蔣麗娜程建貞劉雪晴張曉麗翟登高呂占軍
    關(guān)鍵詞:抑瘤率荷瘤百分率

    蔣麗娜,程建貞,劉 華,劉雪晴,張曉麗,翟登高,呂占軍

    (1.河北北方學(xué)院 免疫教研室,河北 張家口 075000;2.河北北方學(xué)院 檢驗(yàn)系示范中心,河北 張家口075000;3.河北北方學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心,河北 張家口 075000;4.河北醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)

    應(yīng)用免疫生物學(xué)手段治療腫瘤是抗腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)。近年來,新城疫病毒(new castle disease virus,NDV)和一些細(xì)胞因子聯(lián)合抗腫瘤作用的研究日益受到重視。白細(xì)胞介素(interleukin 12,IL-12)是由巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的異二聚體細(xì)胞因子,具有多種生物學(xué)活性,不僅對(duì)腫瘤有直接的抑制作用,而且能有效激發(fā)和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答,使機(jī)體免疫系統(tǒng)有效發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。本文對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤模型采用NDV、IL-12、NDV+IL-12進(jìn)行免疫治療研究,通過T細(xì)胞亞群測定、CTL細(xì)胞殺瘤效應(yīng)等研究,從細(xì)胞免疫的角度分析了NDV聯(lián)合IL-12抗腫瘤作用的機(jī)制,為深入研究NDV抗腫瘤作用機(jī)制,以及研制更加有效的抗腫瘤疫苗奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑 四甲基氮噻唑藍(lán)(thiazolyl blue,MTT)為北京市普京康生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD3單克隆抗體、別藻青蛋白(APC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體及鼠重組IL-12試劑購自深圳晶美生物有限公司。

    1.1.2 動(dòng)物 BALB/c小鼠,18~20 g,雌性,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    1.1.3 病毒和細(xì)胞株 NDV從中國科學(xué)院病毒所購買,血凝效價(jià)為1:800++,用PBS稀釋病毒至1×1010PFU/mL;S180細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物造模 于BALB/c小鼠左后肢皮下接種2×106個(gè)瘤細(xì)胞,荷瘤成功后,開始抑瘤實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 將40只荷瘤成功的小鼠隨機(jī)分為4組,每組為10只。

    生理鹽水(對(duì)照組):荷瘤第7、14及21 d,每只小鼠瘤旁注射生理鹽水0.2 mL。

    NDV免疫治療組:荷瘤第7、14及21 d,每只小鼠瘤旁注射NDV 0.2 mL(即2×109PFU/只/次)。

    0.5ng/mL IL-12免疫治療組:荷瘤第7、14及21 d每只小鼠瘤旁注射IL-120.2 mL。

    NDV+0.5 ng/mL IL-12聯(lián)合免疫治療組:荷瘤第7、14及21天每只小鼠瘤旁注射0.1 mL NDV(即1×109PFU/只/次),同時(shí)在瘤體對(duì)側(cè)位右后肢皮下注射0.1 mL IL-12。

    1.2.3 抑瘤率和瘤指數(shù)的檢測 末次治療1星期后,各組動(dòng)物同時(shí)全部處死,剝離瘤體稱重,計(jì)算抑瘤率和瘤指數(shù)。

    1.2.4 小鼠脾CTL活性測定 取脾細(xì)胞懸液(2×107/mL)0.25 mL做效應(yīng)細(xì)胞,加入S180靶細(xì)胞懸液(2×106mL)0.05 mL,使效靶比為50︰1。體外培養(yǎng)14 d,用酶標(biāo)儀檢測。

    1.2.5 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 收集各組小鼠摘取的眼球抗凝血,采用直接免疫熒光-流式細(xì)胞術(shù),測定外周血中CD3+T、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分率,并計(jì)算CD4+/CD8+比值,P<0.05為差異有顯著性。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)()表示。多樣本比較采用方差分析,如有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠的一般情況觀察

    自第14日后,生理鹽水組小鼠一般狀況變差,逐漸出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)干澀;而同期的NDV組、IL-12組、NDV和IL-12組、小鼠一般狀況明顯優(yōu)于生理鹽水組。

    2.2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠抑瘤率和瘤指數(shù)的比較

    NDV+IL-12組的抑瘤率與NDV、IL-12組相比P<0.01,NDV組和IL-12組進(jìn)行比較,差異無顯著性(P >0.05)(表 1)。

    生理鹽水組小鼠瘤指數(shù)為(7.67±0.67),NDV組、IL-12組、NDV+IL-12組的小鼠瘤指數(shù)分別為(5.26±0.49)、(5.51±1.35),(3.95±0.49)、明顯低于生理鹽水組(P<0.01);NDV組、IL-12單獨(dú)治療組小鼠與NDV+IL-12組相比,差異有顯著性(P<0.01);NDV組小鼠瘤指數(shù)與IL-12組相比,差異無顯著性,P >0.05(表 1)。

    表1 各組荷瘤小鼠的瘤指數(shù)和抑瘤率的變化 ()

    表1 各組荷瘤小鼠的瘤指數(shù)和抑瘤率的變化 ()

    注:1)與生理鹽水組相比,P <0.01;2)與NDV+IL-12組相比P<0.01

    組別 動(dòng)物數(shù)(只)體重(g)瘤重(g)抑瘤率(%) 瘤指數(shù)生理鹽水組 10 23.31±1.511.78±0.12 - 7.67±0.67 NDV 組 10 23.63±2.131.24±0.1730.26±9.251)2) 5.26±0.491)2)IL-12 組 10 22.93±1.911.22±0.1331.85±7.241)2) 5.51±1.351)2)NDV+IL-12 組 10 23.24±2.550.91±0.0748.96±3.801) 3.95±0.491)

    表2 各組荷瘤小鼠CTL細(xì)胞活性的比較()

    表2 各組荷瘤小鼠CTL細(xì)胞活性的比較()

    注:1)與生理鹽水組相比,P <0.01;2)與 NDV+IL-12組相比 P <0.01;3)與 IL-12組相比,P<0.05

    組別 動(dòng)物數(shù)(只) CTL活性生理鹽水組 10 25.05±1.20 NDV 組 10 47.03±3.551)2)3)IL-12 組 10 35.19±3.931)2)NDV+IL-12 組 10 63.84±3.381)

    表3 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細(xì)胞亞群百分率(%)表達(dá)的比較 (%,)

    表3 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細(xì)胞亞群百分率(%)表達(dá)的比較 (%,)

    注:1)與生理鹽水組相比,P <0.05;2)與 NDV+IL-12組相比,P <0.05;3)與 IL-12組相比,P<0.05

    組別CD3 CD4 CD8 CD4/CD8正常對(duì)照組生理鹽水組68.00±7.0740.86±4.2045.70±5.5028.68±4.1325.00±2.9711.96±1.021.82±0.182.41±0.42 NDV組IL-12組NDV+IL-12組56.26±2.791) 42.18±2.211) 15.96±1.221)3) 2.65±0.1555.12±6.631)2) 39.65±5.081) 14.53±1.731) 2.73±0.3064.53±9.201) 48.08±8.911) 17.92±1.561) 2.68±0.44

    2.3 脾CTL細(xì)胞活性的檢測

    從表 2 可以看出,NDV、IL-12、NDV+IL-12 組的CTL細(xì)胞活性與生理鹽水組相比有顯著性差異(P<0.01);NDV+IL-12組的CTL細(xì)胞活性比NDV、IL-12組要高(P<0.01);IL-12組的CTL細(xì)胞活性低于NDV組(P<0.05)。

    2.4 荷瘤小鼠血液中T細(xì)胞亞群的變化

    從表3可見,生理鹽水組荷瘤小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分率均低于 NDV、IL-12、NDV+IL-12組。結(jié)果表明,采用NDV、IL-12單獨(dú)治療或NDV+IL-12聯(lián)合治療后,上述指標(biāo)均得到明顯改善(P<0.05),且 CD4+/CD8+比值也升高。

    3 討論

    腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體的免疫功能,特別是與細(xì)胞免疫功能有著密切的關(guān)系。細(xì)胞免疫在機(jī)體的免疫監(jiān)視及抗腫瘤免疫中具有極為重要的作用[2]。提高機(jī)體免疫功能是抗腫瘤作用的一條重要途徑[3,4]。

    在本研究中,我們采用NDV、鼠源性IL-12和NDV+IL-12聯(lián)合分組接種,比較觀測了各組對(duì)荷瘤小鼠的免疫效果。結(jié)果顯示,NDV、IL-12和NDV+IL-12具有良好的抗腫瘤效果。NDV與IL-12聯(lián)合免疫比單獨(dú)應(yīng)用NDV、IL-12效果更好,腫瘤生長受到明顯抑制,而且CD3+、CD4+細(xì)胞百分率與正常小鼠相當(dāng),但是CD8+細(xì)胞百分率明顯低于正常小鼠,CD4/CD8比率明顯高于正常小鼠。另外,NDV、IL-12單獨(dú)治療組CD4+、CD8+細(xì)胞百分率及比率方面也顯示類似情況,提示CD4+T細(xì)胞的抗腫瘤作用可能比CD8+T細(xì)胞更重要。原來認(rèn)為,抗腫瘤細(xì)胞免疫主要是由CTL介導(dǎo)的,但是近年來證實(shí),CD4+T細(xì)胞在有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答中也起著關(guān)鍵的作用[5],本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也初步說明,CD4+T細(xì)胞在抗腫瘤作用中具有重要作用。

    IL-12是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫極為關(guān)鍵的細(xì)胞因子,即能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化,也能刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ,促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞增殖和增強(qiáng)CTL細(xì)胞毒活性[6~8]。良好的抗腫瘤狀態(tài)需要Th1細(xì)胞占優(yōu)勢[9,10],增強(qiáng)Th1細(xì)胞功能,提高機(jī)體細(xì)胞免疫能力,可成為抗腫瘤免疫治療的手段之一[11~14]。NDV作為活的病毒能很好地誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,用NDV+IL-12聯(lián)合免疫小鼠,能人工改善應(yīng)答環(huán)境,有利于CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化,可能是抗瘤效果好于NDV、IL-12單獨(dú)免疫的重要原因。

    治療組CD3+T細(xì)胞百分率明顯高于生理鹽水對(duì)照組,提示S180肉瘤生長可能有抑制T細(xì)胞活化、增殖及破壞T細(xì)胞的作用,從而降低了小鼠的抗腫瘤作用,其機(jī)制需要深入研究。另外,本研究顯示,NDV組小鼠CTL活性及百分率明顯高于IL-12組,可能NDV的抑瘤作用好于IL-12,但是CD4+T細(xì)胞百分率、抑瘤率和抑瘤指數(shù)并無明顯差別,需要延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間進(jìn)一步觀測。

    綜上所述,不論采用NDV、IL-12單獨(dú)治療還是NDV+IL-12聯(lián)合治療,在體內(nèi)都具有一定的的抗腫瘤作用,細(xì)胞免疫方面的指標(biāo)(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)均得到明顯改善,提高了細(xì)胞免疫功能。本研究結(jié)果提示,聯(lián)合免疫效果好于單獨(dú)免疫,其詳細(xì)協(xié)同抗腫瘤作用機(jī)制有待深入研究。

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