不同發(fā)酵茶體外α-葡萄糖苷酶和巨噬細(xì)胞泡沫化抑制活性初步研究*

程 悅，吳文玉，苗愛清，徐索文，龐 式，王鐵橋，劉培慶，王冬梅

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所， 廣東 英德 513000)

茶葉中含有多種酚類抗氧化成分，已有研究證明茶多酚類成分有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[1-3]，并對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用[4]。同一茶鮮葉在各種茶的獨(dú)特的加工過程中，茶葉中原有的化學(xué)成分分別發(fā)生著不同的變化，形成了不同發(fā)酵類型茶的各自獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)，同時(shí)也使它們?cè)谒幚砘钚陨媳憩F(xiàn)出不同的特點(diǎn)。烏龍茶、紅茶、黑茶分別為半發(fā)酵茶、發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶。為了比較這3種不同發(fā)酵茶在降糖降脂抗動(dòng)脈粥樣硬化活性上的差異，本論文以白葉單樅茶同一季節(jié)、同一標(biāo)準(zhǔn)采摘的茶鮮葉為原料，按照傳統(tǒng)加工工藝，分別制成烏龍茶、紅茶、黑茶，對(duì)它們的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性和對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞泡沫化形成的抑制活性進(jìn)行了研究比較。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采摘秋季白葉單樅一芽三、四葉及同等嫩度的對(duì)莢葉后，按照如下方法分別加工制成烏龍茶、紅茶和黑茶。

烏龍茶：茶鮮葉→曬青→涼青→做青(4次)→殺青→揉捻→毛火→足火→揀梗、黃片→茶樣。

紅茶：茶鮮葉→萎凋→揉切→篩分→發(fā)酵→毛火→足火→撈篩→茶樣。

黑茶：茶鮮葉→攤青→殺青→揉捻→曬干→發(fā)水漚堆→翻堆(6次)→晾→烘干→篩分→揀?！铇?。

各種茶樣粉碎后過40目篩，置于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶(Saccharomycesp. )(日本和光公司)，葡萄糖測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，阿卡波糖(北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司)。小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞株由中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院凌文華教授饋贈(zèng)。健康人新鮮血漿購自中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)自制。RPMI-1640 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)，胎牛血清(FBS)(美國Hyclone 公司)，四甲基噻唑藍(lán)(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG6000)、酶學(xué)熒光法檢測膽固醇試劑盒、抗生素(青、鏈霉素)、麥芽糖、兒茶素均購自美國Sigma 公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

酶聯(lián)免疫檢測儀ELK-800型(Bio-Tek)，超速離心機(jī)Optima LE-80K(BECKMAN COULTER)，Centrifuge5417R(Eppendorf)，超聲細(xì)胞破碎儀(Branson Digital Sonifier)，TU-1810紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 茶水提物的制備

將茶葉粉末置于燒杯中，加入10倍量的水，超聲20 min后，再置于沸水浴中20 min，脫脂棉過濾，茶渣再重復(fù)提取一次。合并2次水提液，濃縮至干，備用。

1.4 茶多酚和茶色素的含量測定

茶多酚采用酒石酸亞鐵比色法，茶黃素、茶紅素和茶褐素采用系統(tǒng)分析法[5]。

1.5 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

取3種茶的水提取物適量分別溶于生理鹽水，配成50 μg/mL的供試茶樣溶液。取供試茶樣溶液20 μL，與2 μL 20 unit/mL α-葡萄糖苷酶溶液混合，在37 ℃搖床中振搖10 min后，加入20 μL 0.05 mol/L的麥芽糖溶液，37 ℃搖床中繼續(xù)振搖10 min。以上反應(yīng)在96孔培養(yǎng)板上完成，采用葡萄糖氧化酶法(葡萄糖測定試劑盒測定)，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm下測定吸光度值(A值)，以葡萄糖的生成量，計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制活性；以α-糖苷酶抑制劑阿卡波糖為陽性對(duì)照藥物，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.6 對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7泡沫化的抑制作用研究

1.6.1 對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7增殖的影響 采用噻唑蘭(MTT)法測定各茶水提物在不同濃度下對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響。

1.6.2 對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7泡沫化的影響

1)細(xì)胞處理：在六孔板接種細(xì)胞，置37℃、φ=5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞完全貼壁。換無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入新鮮的無血清培養(yǎng)液，再加入不同濃度的各種茶水提物，模型組加入同體積的PBS，培養(yǎng)2 h。加入刺激因素ox-LDL使其終濃度為50 μg/mL，培養(yǎng)24 h。正常對(duì)照組(空白組)以同體積的培養(yǎng)基代替ox-LDL。

2)細(xì)胞內(nèi)膽固醇及蛋白質(zhì)含量的測定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以5 000 r/min離心10 min，棄上清收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。加入0.1 mL異丙醇，超聲破碎3次，每次15 s，靜置120 min。取15 μL樣品加入到135 μL總膽固醇(TC)分析液(0.1 U/mL膽固醇氧化酶、1 U/mL過氧化酶、0.010 U/mL膽固醇酯酶、φ=0.05% Triron X-100、1 mmol/L膽酸鈉、0.6 g/mLp-苯乙醇酸)中，37 ℃孵育1 h，熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射波長為410 nm。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定用Lowry法。細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇含量用每克細(xì)胞蛋白質(zhì)所含的TC含量來表示，采用單位蛋白的熒光讀數(shù)A值作為TC含量的比較指標(biāo)。各茶葉提取物對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制率按照如下公式計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 白葉單樅不同發(fā)酵茶中茶多酚和茶色素的含量

如表1所示，茶多酚含量(w)從高到低依次為烏龍茶 > 紅茶 > 黑茶；茶黃素和茶紅素含量(w)以紅茶最高，黑茶最低，它們是紅茶茶湯主要的橙黃色色素；茶褐素含量(w)以黑茶最高，約為烏龍茶、紅茶中含量的2.5倍，說明黑茶在渥堆中形成大量茶褐素，而其它成分則大量減少，其對(duì)黑茶茶湯紅褐色品質(zhì)的形成有著至關(guān)重要的作用，是黑茶獨(dú)特的品質(zhì)成分。

表1 白葉單樅不同發(fā)酵茶茶多酚和茶色素的含量

Table 1 Contents of tea polyphenols, theaflavins, thearubigins and theabrownines in different fermented tea products prepared fromCamelliasinensisvar.baiyedancong

烏龍茶紅茶黑茶w(茶多酚)/%36.1321.8312.33w(茶黃素)/%0.280.480.21w(茶紅素)/%7.589.033.47w(茶褐素)/%5.485.5713.77

2.2 白葉單樅不同發(fā)酵茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖1可見，3種不同發(fā)酵茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性從強(qiáng)到弱依次為紅茶>黑茶>烏龍茶，預(yù)示較深度的發(fā)酵過程或微生物后發(fā)酵過程有利于具有α-葡萄糖苷酶抑制活性物質(zhì)的生成。各個(gè)藥物組與空白對(duì)照組相比達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，且3種茶的組間差異也達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。

圖1 不同發(fā)酵茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性與對(duì)照相比**P<0.01

2.3 白葉單樅不同發(fā)酵茶對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制作用

2.3.1 不同發(fā)酵茶水提物對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性

由表2可見，隨著茶水提物質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞的存活率降低，3種茶水提物質(zhì)量濃度在低于100 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，細(xì)胞存活率較高。因此選用茶水提物質(zhì)量濃度為50和100 μg/mL來進(jìn)行后續(xù)對(duì)巨噬系Raw264.7細(xì)胞泡沫化抑制活性的比較研究。

表2 不同發(fā)酵茶對(duì)Raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性1)

2.3.2 不同發(fā)酵茶水提物對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制活性 由圖2可見，3種不同發(fā)酵茶水提物對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞泡沫化都表現(xiàn)出一定程度的抑制作用。在水提物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，3種茶的抑制活性無明顯差別，抑制率在35%～37%之間，紅茶組和黑茶組與對(duì)照組相比達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，3種茶葉組間并無顯著差異(P>0.05)；而當(dāng)水提物質(zhì)量濃度提高為100 μg/mL時(shí)，黑茶表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制活性，其抑制率達(dá)到73.29%，紅茶和烏龍茶對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制率分別為62.31%和51.93%，3種茶葉組均與對(duì)照組相比達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，且其組間差異也達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。

圖2 不同發(fā)酵茶對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞泡沫化抑制作用的比較與對(duì)照相比*P<0.05

3 討 論

烏龍茶的加工通過搖青使葉緣摩擦損傷，茶葉僅部分“發(fā)酵”，故稱為半發(fā)酵茶；紅茶由于在加工過程中，鮮葉充分利用了其內(nèi)生酶的生物化學(xué)作用，使茶多酚發(fā)生一系列的反應(yīng)，又稱全發(fā)酵茶；黑茶經(jīng)殺青后再堆悶，多酚類成分在微生物的作用下發(fā)生氧化、聚合，形成后發(fā)酵茶。茶葉中的多酚類成分的含量與其發(fā)酵程度負(fù)相關(guān)，本論文測得不同發(fā)酵茶的茶多酚含量(w)烏龍茶>紅茶>黑茶，而茶褐素在黑茶中的含量遠(yuǎn)高于烏龍茶和紅茶。

3種茶水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，但發(fā)酵程度較高的紅茶和黑茶的活性較烏龍茶高，預(yù)示茶色素類成分可能是其抑制活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。抑制α-葡萄糖苷酶活性，可以有效地抑制食物中碳水化合物的水解和消化，延緩葡萄糖的吸收，從而有效地阻止糖尿病患者餐后血糖的升高，α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為降糖藥物新藥研發(fā)的一個(gè)重要靶標(biāo)。近年來有研究指出，有抗氧化作用的物質(zhì)可以減輕與糖尿病相關(guān)的病理損傷，從而起到防治糖尿病的作用[6]。因茶葉中含的多酚類物質(zhì)均具有較強(qiáng)的抗氧化作用，所以α-葡萄糖苷酶可能只是茶葉發(fā)揮降糖作用的其中一個(gè)靶點(diǎn)，其他的作用靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，巨噬細(xì)胞無限制地?cái)z取氧化脂質(zhì)進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞是其早期病變的重要環(huán)節(jié)[7]。因此, 這種巨噬細(xì)胞泡沫化被認(rèn)為是治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶標(biāo)[8]。本論文探討比較了3種不同發(fā)酵茶對(duì)抑制Raw264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的影響，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，黑茶水提物的抑制活性最高，且與未經(jīng)ox-LDL刺激的正常巨噬細(xì)胞的總膽固醇含量較為接近，預(yù)示黑茶中含量最高的茶褐素類成分可能是其抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的有效成分，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

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